Die Plasma-Metabolomik zeigt große Veränderungen im Kohlenhydrat-, Lipid- und Proteinstoffwechsel von abrupt entwöhnten Mastkälbern

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8176 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mittels 1H-NMR-basierter Metabolomik wurde die Auswirkung einer abrupten Entwöhnung auf das Blutmetabolom von Fleischkälbern untersucht. Zwanzig Angus-Kälber (258 ± 5 kg Körpergewicht; 5 bis 6 Monate alt) wurden nach dem Zufallsprinzip einer nicht entwöhnten (NW) Gruppe zugeteilt, die mit ihrer Mutter auf der Weide blieb, oder einer entwöhnten (W) Gruppe, die sich abrupt von ihrer Mutter trennte Separates Fahrerlager am Tag 0 der Studie. Körpergewicht, Verhalten und Blutproben für Cortisol und Metabolomik wurden an den Tagen 0, 1, 2, 7 und 14 der Studie gemessen. An Tag 1 und 2 verbrachten W-Kälber weniger Zeit mit Weiden und Wiederkäuen und mehr Zeit mit Lautäußerungen und Gehen, hatten eine höhere Konzentration an Cortisol, NEFA, 3-Hydroxybutyrat, Betain, Kreatin und Phenylalanin und eine geringere Häufigkeit von Tyrosin (P < 0,05) im Vergleich zu NW-Kälbern. Im Vergleich zu NW-Kälbern am Tag 14 hatten W-Kälber eine größere (P < 0,01) relative Häufigkeit von Acetat, Glucose, Allantoin, Kreatinin, Kreatin, Kreatinphosphat, Glutamat, 3-Hydroxybutyrat, 3-Hydroxyisobutyrat und sieben AA (Alanin, Glutamat). , Leucin, Lysin, Phenylalanin, Threonin und Valin), aber geringere (P < 0,05) relative Häufigkeit von Lipiden niedriger und sehr niedriger Dichte sowie ungesättigter Lipide. Sowohl PCA als auch OPLS-DA zeigten keine Häufung oder Diskriminierung zwischen den Gruppen am Tag 0 und eine zunehmende Divergenz bis zum Tag 14. Die Blutmetabolomik ist ein nützliches Instrument zur Quantifizierung der akuten Auswirkungen von Stress bei Kälbern in den ersten zwei Tagen nach dem abrupten Absetzen und darüber hinaus. Langfristige Veränderungen im Kohlenhydrat-, Lipid- und Proteinstoffwechsel aufgrund von Ernährungsumstellungen aufgrund der Einstellung der Milchaufnahme und einer stärkeren Abhängigkeit von der Futteraufnahme.

Der Ernährungsbedarf neugeborener und noch nicht wiederkäuender Fleischkälber wird ausschließlich durch Eiweiß, Fett, Kohlenhydrate (hauptsächlich Laktose), Vitamine und Mineralien gedeckt, die aus der Milch aufgenommen werden, die den unentwickelten Pansen umgeht1. Der Übergang vom Vorwiederkäuerstadium zum Wiederkäuerstadium erfolgt bei Fleischkälbern, die auf der Weide aufgezogen werden, schrittweise, da der Verzehr von festem Futter und die Pansengärung zunimmt und das Tier zunehmend auf mikrobielles Protein und VFA angewiesen ist2,3. Eines der herausragendsten Merkmale des Wiederkäuers ist das hohe glukoneogene Potenzial von Propionat, Laktat und AA1. Das abrupte Entfernen eines Kalbes von seiner Mutter (Entwöhnung) im Alter von 3 bis 6 Monaten ist eine Standardpraxis in Rinderproduktionssystemen4. Entwöhnte Kälber können ernährungsbedingten, sozialen und psychischen Belastungen ausgesetzt sein, die zu Verhaltens-, Stoffwechsel-, physiologischen und immunologischen Veränderungen führen5,6. Daher sollten Entwöhnungspraktiken das Tierwohl, die Stoffwechselfunktion und den Ernährungsbedarf der Kälber berücksichtigen2. Frühere Studien konzentrierten sich auf Verhaltensänderungen, Stresshormone und die Immunologie entwöhnter Kälber, die in den ersten 48 Stunden nach dem Absetzen deutlicher sichtbar sind5,7,8,9. Die katabole Wirkung von Stresshormonen wie Cortisol kann die erhöhten Konzentrationen von NEFA im Blut und einen Teil des Rückgangs des ADG nach dem Absetzen erklären10,11. Es ist jedoch zu erwarten, dass die Einstellung der Milchaufnahme von Kälbern auf der Weide zu längerfristigen Stoffwechselveränderungen führen wird, da Nahrungsfett aufgrund der geringen Konzentration im Futter reduziert wird, während Ballaststoffe und die Pansengärung zunimmt. Überraschenderweise ist wenig über Veränderungen der Stoffwechselfunktion weidender Kälber nach dem Absetzen bekannt. Diese Informationen könnten genutzt werden, um neue Strategien zur Linderung von Stoffwechselstress, zur Verbesserung des Wohlbefindens und zur Minimierung des Rückgangs der Tierproduktion nach dem Absetzen zu entwickeln.

Die Stoffwechselfunktion spiegelt sich im Blutmetabolom wider, das Metaboliten wie Lipide, Zucker und AA umfasst, die die Zell-, Gewebe- und Organfunktion beeinflussen12,13. Das Metabolom liegt stromabwärts des Genoms, Transkriptoms und Proteoms und ist dem Phänotyp am nächsten. Dies führte zu der Vermutung, dass das Metabolom der beste Indikator für Veränderungen der biologischen Funktion sein könnte14,15,16. Ein weiteres wichtiges Merkmal des Blutmetaboloms besteht darin, dass es die Integration externer (z. B. Ernährung) und interner (z. B. Genotyp) Faktoren darstellt, die den Stoffwechsel beeinflussen15. Bei Schweinen war das Absetzen mit Veränderungen sowohl der Stoffwechselfunktion als auch des Blutmetaboloms verbunden, und diese Veränderungen konnten teilweise durch eine Argininergänzung ausgeglichen werden17. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass neugeborene Kälber, die mit Kolostrum gefüttert wurden, einen Anstieg der Serumhäufigkeit von Glutamat, Histidin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Valin, Leucin, Isoleucin und Prolin sowie eine Verringerung von Glutamin zeigten13. Es wurden jedoch keine Studien veröffentlicht, die Veränderungen im Blutmetabolom grasender Fleischkälber nach dem Absetzen unter kommerziellen Bedingungen untersuchten.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, Veränderungen im Blutmetabolom von Angus-Rinderkälbern zu charakterisieren, die einem abrupten Absetzen unterzogen wurden. Diese Informationen könnten unser Verständnis der metabolischen Auswirkungen des abrupten Absetzens bei Mastkälbern verbessern und neue Strategien zur Bewältigung des Übergangs liefern. Die Hypothese war, dass ein abruptes Absetzen bei Mastkälbern mit Stress und Ernährungsumstellungen verbunden war, die Stoffwechselreaktionen hervorriefen, die sich im Blutmetabolom widerspiegelten.

Die Studie verfügte über eine Tierethikgenehmigung durch das Tierethikkomitee der Universität Sydney: Protokoll 767. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit der Ethikgenehmigung und den relevanten staatlichen und nationalen Gesetzen, Vorschriften und Kodizes, einschließlich des Animal Research Act 1985 (https://www. dpi.nsw.gov.au/about-us/legislation/list/animal-research), Tierversuchsverordnung 2021 (https://legislation.nsw.gov.au/view/pdf/asmade/sl-2021-477) und Australischer Kodex für die Pflege und Nutzung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke, 8. Auflage 2013 (https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-zwecke ).

Zwanzig multipare Angus-Kühe und ihre Kälber (5 bis 6 Monate alt) wurden unter Standard-Weidebedingungen und -management auf der John Pye Farm der Universität Sydney (Greendale, New South Wales, Australien) gehalten. Die Weiden wurden von Paspalum (Paspalum dilatatum) mit relativ geringen Dichten an Chicorée (Cichorium intybus), Wegerich (Plantago lanceolata), Rotklee (Trifolium pratense) und Weißklee (Trifolium repens) dominiert und enthielten 10,7 % CP, 60,7 % NDF, und 20,6 % ADF. Die Kälber wurden im Frühjahr geboren und blieben von Geburt an bei ihrer Mutter.

Am Tag 0 wurden die Kälber gewogen, nach Geschlecht sortiert und nach dem Zufallsprinzip einer nicht entwöhnten Gruppe zugeordnet, die bei ihrer Mutter blieb (NW; n = 10; 257 ± 6 kg BW), oder einer entwöhnten Gruppe, die sich abrupt von ihrer Mutter trennte (W; n = 10; 258 ± 5 kg KG) und ohne Sicht- oder Hörkontakt mit ihrer Mutter auf eine separate Koppel geschickt. Jede Gruppe bestand aus 7 männlichen (nicht kastrierten) und 3 weiblichen Kälbern. Das Weideland in den beiden Koppeln war in Zusammensetzung und Menge ähnlich. Dies wurde durch Weideprobenahmen und -analysen zu Beginn (Tag 0) und Ende (Tag 14) der Studie überprüft. Zu diesem Zweck wurden zehn Quadrate (0,5 m × 0,5 m) zufällig auf jeder Koppel verteilt und das Futter innerhalb der Quadrate auf Bodenhöhe geschnitten, 48 Stunden lang bei 65 °C getrocknet und gewogen, um die verfügbare Futterbiomasse zu berechnen. Die beiden Kälbergruppen blieben vom Tag 0 bis zum Ende (Tag 14) der Studie in ihrer jeweiligen Koppel. Das Körpergewicht aller Kälber wurde an den Tagen 0, 2, 7 und 14 aufgezeichnet. Blutproben wurden durch Jugularvenenpunktion unter Verwendung von EDTA-haltigen Vakuumröhrchen (BD Vacutainer, Becton Dickinson, NJ, USA) an den Tagen 0, 1, 2, 7 entnommen. und 14 Uhr zwischen 09:00 und 10:00 Uhr. Die Proben wurden etwa 30 Minuten lang bei 4 °C gekühlt, zentrifugiert (2000 × g 30 Minuten lang) und das Plasma bis zur Metabolomanalyse bei –80 °C gelagert.

Das Verhalten wurde anhand von Scan-Proben in 3-Minuten-Intervallen für jedes Tier an den Tagen − 2, − 1, 0, 1, 2, 7 und 14 in Bezug auf den Tag der Entwöhnung (d 0) gemessen. Die Beobachtungen wurden direkt im Feld mithilfe eines Aufzeichnungsblatts mit Tiernummer, Datum und Uhrzeit (in 3-Minuten-Intervallen) durchgeführt, während das Verhalten der Tiere von zwei Beobachtern in den Zeiträumen 7:00 bis 9:00 Uhr und 11:00 Uhr aufgezeichnet wurde Die aufgezeichneten Verhaltensweisen umfassten Grasen, Wiederkäuen, Ausruhen, Saugen, Gehen, Lautäußern (Muhen) und Trinken wie beschrieben18,19.

Die Konzentrationen von Cortisol im Plasma wurden in einem einzigen Test gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt (ADVIA Centaur® Cortisol-Test; Siemens Healthcare Pty Ltd, Bayswater, Victoria, Australien). Die Assay-Empfindlichkeit betrug 2,0 ng/ml und der Intra-Assay-Variationskoeffizient betrug 3,5 %. Die NEFA wurden auch in einem einzigen Test (Randox Australia Pty Ltd, Parramatta, Australien) bestimmt, der zuvor bei Rindern verwendet wurde20. Die Assay-Sensitivität betrug 0,03 mEq/L und der Intra-Assay-Variationskoeffizient betrug 1,4 %.

Die Probenvorbereitungs- und Erfassungsmethoden für die 1H-NMR basierten auf veröffentlichten Protokollen21,22. Man ließ das Plasma bei Raumtemperatur auftauen und ein Aliquot (350 µL) wurde mit 350 µL wässriger (80 % H2O:20 % D2O) Phosphatpufferlösung, einschließlich 0,075 M NaH2PO4, pH = 7,4 (KOH-eingestellt), 0,1 % Natrium, gemischt Azid, 1 mM 3-Trimethylsilyl-1-[2,2,3,3,-2H4]propionat (TSP) in Eppendorf-Röhrchen. Die Proben wurden 30 s lang auf einem Vortex platziert und dann 10 min lang bei 6000 × g zentrifugiert. Aliquots des Überstands (600 µL) wurden zur 1H-NMR-Analyse in 5-mm-NMR-Röhrchen überführt.

1H-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Avance III 400-MHz-Spektrometer aufgenommen, das bei 400,13 MHz für 1H bei 310 K arbeitete und mit einer 5-mm-Breitbandsonde mit inverser Konfiguration ausgestattet war. Die Proben wurden in zufälliger Reihenfolge und automatisiert mit einem SampleCase 24-Probenautomatisierungssystem analysiert. Die Proben wurden mithilfe eines wasserunterdrückten 1D-NMR-Spektrums unter Verwendung der NOESYPRESAT-Pulssequenz (160 Transienten) und einer Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Spinechosequenz mit Vorsättigung (160 Transienten) analysiert. Die Bestrahlung der Lösungsmittelresonanz (Wasser) erfolgte während der Vorsättigungsverzögerung (2,0 s) für alle Spektren und für die wasserunterdrückten 1D-NMR-Spektren auch während der Mischzeit (0,1 s). Die Pulssequenzparameter einschließlich 90°-Puls (~ 12 µs), Pulsfrequenzversatz (~ 1880 Hz), Empfängerverstärkung (90,5) und Pulsleistungen wurden an einer repräsentativen Stichprobe optimiert und dann für die analysierte Kohorte konstant eingestellt. Die spektrale Breite betrug 30 ppm für NOESY-Experimente und 20 ppm für CPMG-Experimente. Die resultierenden Zerfälle der Fourier-Induktion wurden vor der Fourier-Transformation mit einer exponentiellen Linienverbreiterung von 0,3 Hz verarbeitet und mit etwa 32.000 realen Datenpunkten erfasst.

1H-NMR-Rohdatensätze wurden mithilfe der MATLAB 7.0-Software (MathWorks, Natick, MA) automatisch phasengesteuert, grundlinienkorrigiert und auf das α-C1H-Glucosedublett (5,23 ppm) bezogen. Um die analytische Variation zwischen den Proben zu reduzieren, wurde das Restwassersignal (4,67–4,98 ppm) aus dem Datensatz gekürzt. Die probabilistische Quotientennormalisierung wurde in der gesamten Kohorte23 durchgeführt. Die Zuordnung endogener Metaboliten erfolgte mit hoher Zuverlässigkeit unter Verwendung von Chenomx® (Chenomx Inc., Edmonton, AB, Kanada) und durch Bezugnahme auf veröffentlichte Literatur, Online-Ressourcen und Spiking-Experimente24,25,26. Die statistische Rückkopplung von Variablen27 wurde verwendet, um vorverarbeitete NMR-Spektrumsdaten in Merkmale oder Peaks zu gruppieren, die die relative Metabolitenhäufigkeit darstellen.

Nach der Verarbeitung der 1H-NMR-Daten wurde eine multivariate statistische Analyse unter Verwendung von MATLAB 7.0 und SAS (SAS Inc, Cary, NC) durchgeführt. Daten zu Verhalten, ADG, Cortisol, NEFA und der relativen Häufigkeit der identifizierten Metaboliten wurden mithilfe eines linearen Regressionsmodells mit gemischten Effekten analysiert, wobei die Behandlung ein fester Effekt, die Zeit eine wiederholte Messung war, die dem zufälligen Effekt des Kalbs unterworfen war, und Behandlung × Zeit Interaktion. Geschlecht wurde ursprünglich mit der entsprechenden Interaktion in das Modell einbezogen, dieses erwies sich jedoch als unbedeutend (P > 0,05) und wurde daher aus dem Modell gestrichen. Die räumliche Potenzkovarianzstruktur wurde auf der Grundlage des niedrigsten Bayes'schen Informationskriteriums ausgewählt, das den ungleichmäßigen Abstand zwischen wiederholten Messungen berücksichtigt. Alle Variablen und Residuen wurden auf Normalität, Zufallsverteilung und Mittelwert von Null getestet. Daten für Cortisol und NEFA wurden vor der Analyse in log10 umgewandelt, um die Verteilung zu normalisieren. Die Verhaltensdaten wurden verwendet, um den Prozentsatz der Beobachtungen jedes Verhaltens für jedes Tier und jeden Tag zu berechnen, und dann wurden die Daten vor der statistischen Analyse mithilfe der Arkussinus-Quadratwurzel transformiert. Unterschiede zwischen den Behandlungsmitteln wurden innerhalb jedes Zeitpunkts durch paarweise Vergleiche berechnet.

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der normalisierten Spektren wurde verwendet, um potenziell ungewöhnliche Spektren (Ausreißer) zu identifizieren und offensichtliche Muster oder Trends in den Metabolitenprofilen zu erkennen28. Es wurden keine Ausreißer festgestellt und anschließend wurde eine zweite PCA-Analyse mit der relativen Häufigkeit der 26 identifizierten Metaboliten zu jedem Zeitpunkt durchgeführt, um nach der Darstellung der Hauptkomponenten die Häufung von Behandlungsgruppen zu erkennen. Die orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) wurde verwendet, um Tiere zwischen den Behandlungsgruppen zu unterscheiden (überwachte Klassifizierung). Diese OPLS-DA-Modelle identifizieren Spektren oder Häufigkeiten von Metaboliten, die es ermöglichen, jedes Tier einer bestimmten Behandlungsgruppe zuzuordnen. Die generierten OPLS-DA-Modelle wurden 1000 Kreuzvalidierungs-Permutationstests unterzogen, um die Gültigkeit der überwachten Modelle zu bewerten28,29,30,31. Die OPLS-DA-Modelle wurden sowohl aus den gesamten 1H-NMR-normalisierten Spektren als auch aus den 26 identifizierten Metaboliten erstellt, um festzustellen, ob ein Datensatz Tiere besser zwischen Entwöhnungsgruppen unterscheiden kann. Die Vorhersagefähigkeit von OPLS-DA-Modellen wurde anhand des Q2-Werts gemessen30.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede (P > 0,05; Daten nicht gezeigt) zwischen den Behandlungen in grüner oder trockener Weidebiomasse zu Beginn (2130 ± 217 bzw. 555 ± 67 kg TM) oder Ende (1753 ± 105 und 668 ± 47 kg TM) festgestellt , bzw.) des Prozesses. Das BW an Tag 0 und Tag 14 unterschied sich zwischen den Behandlungen nicht (P > 0,05) (Daten nicht gezeigt). Der Gesamt-ADG war bei NW-Kälbern (1,05 ± 0,079 kg/Tag) höher (P = 0,014) als bei W-Kälbern (0,74 ± 0,084 kg/Tag). Die Wechselwirkung zwischen Behandlung und Tag (P < 0,001) zeigte, dass W-Kälber zwischen d 0 und d 2 an Gewicht verloren, während NW-Kälber in diesem Zeitraum an Gewicht zunahmen (P = 0,06; Abb. 1). Der ADG zwischen Tag 2 und Tag 7 war bei W-Kälbern größer als bei NW-Kälbern (P < 0,05) und der gegenteilige Effekt wurde zwischen Tag 7 und Tag 14 festgestellt (P < 0,05; Abb. 1). Alle Verhaltensweisen zeigten eine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Tag (P < 0,001; Abb. 2). Sowohl W- als auch NW-Kälber verbrachten für jede Aktivität an d − 2 und − 1 ähnlich viel Zeit (P > 0,10). Im Gegensatz dazu verbrachten W-Kälber im Vergleich zu NW-Kälbern an Tag 0 (P < 0,05), Tag 1 (P = 0,06) und Tag 7 (P < 0,05) eine kürzere Zeit auf der Weide, am Tag 2 jedoch länger (P < 0,05). W-Kälber verbrachten im Vergleich zu NW-Kälbern am Tag 0, Tag 1 und Tag 2 weniger Zeit mit Wiederkäuen und mehr Zeit mit Lautäußerungen und Gehen (P < 0,05; Abb. 2). Es gab keine Verhaltensunterschiede (P > 0,05) zwischen W- und NW-Kälbern am Tag 14, mit Ausnahme einer kürzeren Saugzeit an den Muttertieren und einer längeren Gehzeit in W im Vergleich zu NW-Kälbern (P < 0,05).

Wachstumsrate von entwöhnten und nicht entwöhnten Angus-Kälbern. Die Entwöhnung erfolgte am Tag 0. W ist der Haupteffekt der Entwöhnung; D ist der Haupteffekt von Day im Verhältnis zur Entwöhnung. †, *, **, *** Werte innerhalb eines Tages unterscheiden sich oder tendieren dazu, zwischen den Behandlungsgruppen zu variieren (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Verhalten von entwöhnten und nicht entwöhnten Angus-Kälbern im Verhältnis zum Zeitpunkt der Entwöhnung (Tag 0 lag nach der Entwöhnung). W ist der Haupteffekt der Entwöhnung; D ist der Haupteffekt von Day im Verhältnis zur Entwöhnung. †, *, **, *** Werte innerhalb eines Tages unterscheiden sich zwischen den Behandlungsgruppen (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Eine Wechselwirkung zwischen Entwöhnung und Tag wurde für die Plasmakonzentrationen von Cortisol (P < 0,05) und NEFA (P < 0,001; Abb. 3) beobachtet. Die W-Kälber wiesen tendenziell eine höhere Cortisolkonzentration am Tag 1 (P < 0,10) und 2 (P < 0,01) auf als die Kälber im Nordwesten, es wurden jedoch keine Unterschiede zwischen den Gruppen am Tag 7 und 14 beobachtet (P > 0,10). Die Plasmakonzentrationen von NEFA waren an Tag 1, Tag 2 und Tag 7 bei W-Kälbern höher (P < 0,01) als bei NW-Kälbern (P < 0,05), ohne Unterschiede an Tag 0 und Tag 14 (P > 0,10; Abb. 3). .

Blutkonzentration von Cortisol und nicht veresterten Fettsäuren (NEFA) für entwöhnte und nicht entwöhnte Angus-Rinderkälber im Verhältnis zum Zeitpunkt der Entwöhnung am Tag 0 (Blutprobe vor der Entwöhnung). W ist der Haupteffekt der Entwöhnung; D ist der Haupteffekt von Day im Verhältnis zur Entwöhnung. †, *, **, *** Werte innerhalb eines Tages unterscheiden sich zwischen den Behandlungsgruppen (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Aus den 1H-NMR-Spektren wurden insgesamt 26 Metaboliten identifiziert (Abb. 4, 5 und 6). Die relative Konzentration der Metaboliten bei NW-Kälbern änderte sich im Laufe der Zeit nicht (P > 0,05), während sich bei W-Kälbern alle Metaboliten im Laufe der Zeit veränderten (P < 0,05). Unterschiede zwischen NW- und W-Kälbern traten nach dem Absetzen bei 24 der 26 Metaboliten auf. Die Ausnahmen bildeten AA-Histidin und Glutamin, die keine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Tag zeigten (P > 0,05). Einige Metaboliten zeigten den größten Unterschied zwischen den Entwöhnungsgruppen am Tag 1 und Tag 2, andere am Tag 14 (Abb. 4, 5 und 6). Entwöhnte Kälber wiesen an Tag 1 oder Tag 2 eine geringere Menge an Tyrosin und eine größere Menge an Isoleucin auf als Kälber aus nordwestlicher Richtung (P < 0,10), ohne Unterschiede an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 (P > 0,10). Am 2. und 7. Tag war das Betain bei W-Kälbern höher als bei NW-Kälbern (P < 0,05; Abb. 6). Die relative Häufigkeit anderer Metaboliten war bei W-Kälbern im Vergleich zu NW-Kälbern nur an Tag 7 oder Tag 14 oder an Tag 7 und Tag 14 größer, einschließlich einer Gruppe von AA (Valin, Alanin, Threonin, Leucin, Lysin, Threonin), Allantoin, Acetat und Glykoprotein; und geringere Häufigkeit bei W-Kälbern im Vergleich zu NW-Kälbern für VLDL/LDL und ungesättigte Lipide (P < 0,05). Eine andere Gruppe von Metaboliten zeigte eine größere relative Häufigkeit bei W-Kälbern im Vergleich zu NW-Kälbern vom Tag 1 oder Tag 2 bis zum Tag 14, einschließlich Phenylalanin, Glutamat, Kreatinin, Kreatin, Kreatinphosphat, Glucose, 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyisobutyrat (P < 0,10; Abb. 4, 5, 6).

Relative Konzentration der Plasmametaboliten von entwöhnten und nicht entwöhnten Angus-Rinderkälbern im Verhältnis zum Zeitpunkt der Entwöhnung am Tag 0 (Blutprobe vor der Entwöhnung). W ist der Haupteffekt der Entwöhnung; D ist der Haupteffekt von Day im Verhältnis zur Entwöhnung. †, *, **, *** Werte innerhalb eines Tages unterscheiden sich zwischen den Behandlungsgruppen (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Die unbeaufsichtigten PCA-Diagramme mit den 26 identifizierten Metaboliten als Prädiktoren in Abb. 7 stellen die erste Hauptkomponente (PC1, -Achse). Der PC2 berücksichtigt die größtmögliche Varianz in den Daten unter der Bedingung, dass er orthogonal zur vorhergehenden Komponente ist. Die durch die ersten beiden PCs erklärte Varianz lag für jeden Tag in Bezug auf die Entwöhnung bei über 50 % (Abb. 7). Vor dem Absetzen (d 0) zeigte die PCA keine offensichtliche Unterscheidung zwischen NW- und W-Kälbern anhand ihrer Metabolome, wie die Überlappung der beiden Kälbergruppen zeigt (Abb. 7A). Am Tag 1 nach dem Absetzen zeigte die PCA eine Trennung zwischen NW- und W-Kälbern (Abb. 7B). Diese Trennung blieb bei Tag 2 (Abb. 7C), Tag 7 (Abb. 7D) und Tag 14 (Abb. 7E) deutlich.

Hauptkomponentenanalyse der 1H-NMR-Spektren von nicht entwöhnten (offene Kreise) und entwöhnten (gefüllte Kreise) Angus-Kälbern (A) unmittelbar vor dem abrupten Absetzen, (B) d 1, (C) d 2, (D) d 7, und (E) d 14 nach dem Absetzen. Die Ellipsen dienen dazu, das Fehlen einer Häufung am Tag 0 sowie die Häufung der nicht entwöhnten (gestrichelte Umrisslinie) und der entwöhnten Gruppe (durchgezogene Umrisslinie) an verschiedenen Tagen nach dem Absetzen hervorzuheben.

Ein multivektorüberwachtes OPLS-DA-Streudiagramm unter Verwendung des gesamten Spektrums jeder Probe verdeutlichte auch die Unterschiede im Blutmetabolom von Kälbern in Abhängigkeit von Zeit und Entwöhnungsstatus (Abb. 8). Das Blutmetabolom war am Tag 1 nach der Entwöhnung deutlich verändert, was bis zum Tag 14 nach der Entwöhnung anhielt. Die mit der Zeit zunehmende Trennung zwischen W- und NW-Kälbern deutete darauf hin, dass das Metabolom mit zunehmender Zeit nach dem Absetzen weiter divergierte.

Stabilität der Metabotypen von Angus-Kälbern im Zusammenhang mit der Zeit und der Entwöhnungsbehandlungsgruppe (entwöhnte oder nicht entwöhnte Kälber). Zweidimensionales Ergebnisdiagramm des OPLS-Modells (2 prädiktive und 5 orthogonale Komponenten), abgeleitet aus 1H-NMR-Spektren aus dem Plasma von Angus-Kälbern (Zeitpunkt, dunkelblau bis rot), die nicht entwöhnt (offene Kreise) und entwöhnt (geschlossene Kreise) waren. . Die Zeitpunkte sind 0 (lila), 1 (blau), 2 (grün), 7 (orange) und 14 (rot) nach dem Absetzen.

Anschließend wurden für jeden Tag der Blutentnahme separate Unterscheidungsmodelle erstellt, die entweder das gesamte 1H-NMR-Spektrum oder die 26 identifizierten Metaboliten verwendeten (Tabelle 1). Am Tag 0 zeigte der Q2-Wert an, dass der OPLS-DA keine prädiktive Gültigkeit dafür hatte, ob Kälber zur NW- oder W-Gruppe gehörten (Tabelle 1). Die Q2-Werte für d 1 bis 14 lagen bei > 0,40, was bestätigte, dass der OPLS-DA mithilfe des gesamten Spektrums und der relativen Häufigkeit von Metaboliten genau zwischen NW- und W-Kälbern unterscheiden konnte (Tabelle 1). Vorhersagen unter Verwendung der Metaboliten schienen aufgrund des etwas höheren Q2 etwas besser abzuschneiden als das gesamte Spektrum. Zufällige Permutationstests bestätigten, dass alle Modelle nach der Änderung des Entwöhnungsstatus zwischen den Behandlungsgruppen unterscheiden konnten.

Ziel der vorliegenden Studie war es, die Auswirkung einer abrupten Entwöhnung auf das Blutmetabolom von Fleischkälbern zu charakterisieren, gemessen mittels 1H-NMR und unterstützt durch traditionelle Messungen des Stress- und Energiegleichgewichts wie ADG, Cortisol, NEFA und Verhalten. Die PCA an jedem Probenahmetermin wurde als unbeaufsichtigte Klassifizierungsmethode durchgeführt, um die mögliche Gruppierung von Kälbern in eine W- oder NW-Gruppe gemäß dem Metabolom zu bewerten. Diese Analyse bestätigte, dass die Entwöhnung erhebliche Auswirkungen auf die Stoffwechselfunktion hatte, sodass eine Gruppentrennung ausschließlich auf der Grundlage des Blutmetaboloms möglich war. Diese Ergebnisse wurden durch die überwachte Klassifizierung (OPLS-DA) weiter bestätigt, die zeigte, dass eine genaue Unterscheidung entweder mithilfe des gesamten NMR-Spektrums oder der identifizierten Metaboliten erreicht werden kann. Darüber hinaus zeigten sowohl die PCA- als auch die OPLS-DA-Analyse, dass sich das Metabolom von W- und NW-Kälbern vor dem Absetzen nicht unterschied, aber seit dem Absetzen eine deutliche Gruppendivergenz bestand. Dies ist nach bestem Wissen der Autoren die erste veröffentlichte Studie, die die Veränderungen im Blutmetabolom von Mastkälbern nach dem Absetzen untersucht. Unterschiede im Blutmetabolom zwischen NW- und W-Kälbern ließen sich nicht durch die Gesamtzahl der Weiden oder die verfügbare grüne Biomasse erklären, was für beide Gruppen ähnlich war. Daher sind die bei W-Kälbern beobachteten Stoffwechselveränderungen wahrscheinlich auf eine Kombination aus physiologischen und psychologischen Stressfaktoren, der Art der aufgenommenen Nährstoffe und Veränderungen der Stoffwechselfunktion infolge der Unterbrechung der Milchaufnahme nach der physischen Trennung des Kalbes von der Mutter zurückzuführen. Einstellung des Säugens, Wegfall der sozialen Unterstützung vom Muttertier und Veränderung der sozialen Organisation2,4,32. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kälber der vorliegenden Studie 5 bis 6 Monate alt waren und die Entwicklung des Retikulorumen voraussichtlich mit der in diesem Alter verfügbaren festen Nahrung abgeschlossen sein wird33. Allerdings säugten die Kälber während der vorliegenden Studie immer noch, was darauf hindeutet, dass ein Teil der aufgenommenen Energie und Nährstoffe aus der Muttermilch stammte. Verzehrte Milch umgeht den Pansen, wird im Labmagen verdaut und im unteren Magen-Darm-Trakt absorbiert33. Die Verringerung der relativen Plasmakonzentration von VLDL/LDL und ungesättigten Lipiden bei W-Kälbern vom Tag 0 bis zum Tag 14 könnte auf die abrupte Verringerung der Fettaufnahme aus der Milch und die Abhängigkeit von der Futteraufnahme zurückzuführen sein. Futtermittel haben einen sehr geringen Fettgehalt (~ 1 % der TM), wohingegen Rindermilch einen hohen Fettgehalt von etwa 30 % der TM aufweist33.

Im Gegensatz zum langfristigen Rückgang der Lipide könnten die deutlichen Unterschiede zwischen W- und NW-Kälbern in der ersten Woche nach dem Absetzen in der vorliegenden Studie physiologische Veränderungen durch Stresshormone widerspiegeln. Frühere Untersuchungen kamen zu dem Schluss, dass der Entwöhnungsstress akut war und nur von kurzer Dauer (bis zu 48 Stunden) war, sofern die Bedingungen angemessen waren2. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zu ADG, Cortisol und Verhalten (Stimmen, Gehen und Grasen) stützen diese Beobachtung, da diese Variablen in Übereinstimmung mit früheren Studien am Tag 7 auf die Werte vor dem Absetzen zurückgekehrt sind19. Erhöhtes Cortisol im Blut beeinflusst ein breites Spektrum physiologischer Prozesse bei Rindern, darunter den Stoffwechsel34,35 und die Immunfunktion5,6,36. In der vorliegenden Studie erreichte die Konzentration von NEFA, Betain und 3-Hydroxybutyrat ebenfalls am Tag 2 nach dem Absetzen ihren Höhepunkt, blieb jedoch bis zum Tag 7 bzw. 14 erhöht. Im Gegensatz dazu waren Cortisol und Verhaltensweisen, die auf Stress hinweisen, bereits am Tag 7 auf die Werte vor dem Absetzen zurückgekehrt. Erhöhte NEFA-, Betain- und 3-Hydroxybutyrat-Werte bei Rindern spiegeln im Allgemeinen eine Zunahme der Lipolyse und Körperfettmobilisierung wider, die durch Stress verursacht werden kann Glukokortikoide, hoher Energiebedarf oder negative Energiebilanz2,37. Die W-Kälber verloren am Tag 2 nach dem Absetzen an Gewicht, allerdings nahmen sowohl NW- als auch W-Kälber danach an Gewicht zu, was darauf hindeutet, dass es keine negative Energiebilanz gab. Daher deutet die Feststellung, dass W-Kälber im Vergleich zu NW-Kälbern ein geringeres ADG aufwiesen, auf einen Cortisol-vermittelten Effekt auf die Energienutzung oder eine Ernährungsbelastung durch eine geringere Nährstoffaufnahme oder beides hin.

Die zeitlichen Trends in der Häufigkeit von NEFA bei W-Kälbern unterschieden sich deutlich von denen von Lipiden, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen nicht den gleichen Stoffwechselweg haben, obwohl beide Teil des Lipidstoffwechsels sind. Diese Spekulation wird dadurch gestützt, dass die steigende Fettkonzentration im Milchaustauscher keinen Einfluss auf NEFA und Triglyceride im Blut von Kälbern hat38. Darüber hinaus gab es in der vorliegenden Studie keine Korrelation zwischen NEFA und Lipiden (P > 0,05; Daten nicht gezeigt). Daher können durch 1H-NMR gemessene Lipide aus Nahrungsquellen stammen, während NEFA aus der Fettmobilisierung stammen kann.

Betain ist ein Methylspender, der am Protein- und Lipidstoffwechsel beteiligt ist, die antioxidative Kapazität zum Schutz der Zellen vor Stress verbessert und osmoregulatorische Eigenschaften in den Zellen hat39. Bei Übergangsmilchkühen stieg die Produktion von Betain bei negativer Energiebilanz, was zu einem Anstieg der Plasmakonzentration von NEFA und 3-Hydroxybutyrat führte, um die Energieproduktion durch Lipolyse zu unterstützen, wenn die Plasmaglukosekonzentration abnahm40. Darüber hinaus verbesserte die Betain-Supplementierung in Zeiten von Hitzestress die Milchproduktion bei Milchkühen41,42 sowie das Wachstum und die Fettablagerung bei Rindern43,44. Es wird als wahrscheinlich angesehen, dass die W-Kälber der vorliegenden Studie die Betainproduktion steigerten, um die Lipolyse und Oxidation von Triglyceriden zu verbessern und so die für die Stressreaktion beim Absetzen erforderliche Energie bereitzustellen. Die vorliegenden Ergebnisse unterscheiden sich jedoch von laktierenden Milchkühen, da die Kälber im Gegensatz zu Übergangsmilchkühen keine negative Energiebilanz aufwiesen und die Glukosekonzentration in W im Vergleich zu NW-Kälbern anstieg.

In der vorliegenden Studie nahm die relative Häufigkeit von Tyrosin bei W-Kälbern in den ersten zwei Tagen nach dem Absetzen ab, was darauf hindeutet, dass Tyrosin auch eine wichtige Rolle bei der Stressreaktion auf das Absetzen spielte. Tyrosin ist eine Vorstufe mehrerer Neurotransmitter des Katecholaminwegs, die an der Stressreaktion beteiligt sind, darunter Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin45,46,47. Es wird vermutet, dass die akute Stressreaktion beim Absetzen den Bedarf an und die Nutzung von Tyrosin erhöhte, was zu einer Verringerung seiner Konzentration im Blut führte. Allerdings gibt es kaum Untersuchungen zur Rolle von Tyrosin bei der Stressreaktion von Rindern und es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um fundiertere Schlussfolgerungen zu ziehen.

Glykoproteine sind Akute-Phase-Proteine, die bei Entzündungen, Infektionen, Stress und Traumata zunehmen48. Der Anstieg der relativen Häufigkeit von Glykoprotein bei W-Kälbern im Vergleich zu NW-Kälbern spiegelt möglicherweise die allgemeine Stressreaktion von W-Kälbern auf ein abruptes Absetzen wider. Akute-Phase-Proteine sind jedoch im Allgemeinen nicht spezifisch und es ist unklar, ob die durch NMR gemessenen Glykoproteine mit denen übereinstimmen, die mit anderen Techniken wie ELISA oder Chromatographie gemessen werden. Dennoch sind diese Ergebnisse wichtig, da sie das Potenzial der Blutmetabolomik zur Messung mehrerer Metaboliten belegen, die auf unterschiedliche Reaktionen und Stoffwechselwege hinweisen.

Im Gegensatz zu den Metaboliten, die den akuten Stress beim Absetzen widerzuspiegeln schienen, erreichten andere Metaboliten ihre größte relative Konzentration am Tag 14, wie Valin, Alanin, Leucin, Lysin, Kreatinin, Kreatin, Kreatinphosphat, Acetat und Glucose. Es wird vermutet, dass diese Metaboliten eine Veränderung der Stoffwechselfunktion widerspiegeln, die entweder auf eine Ernährungsumstellung, chronischen Stress oder beides zurückzuführen ist. Die Tatsache, dass in der vorliegenden Studie im Laufe der Zeit keine signifikanten Veränderungen im Metabolom von NW-Kälbern auftraten, legt nahe, dass diese Metaboliten Stoffwechselanpassungen von W-Kälbern widerspiegeln. In der vorliegenden Studie wurde das Metabolom jedoch nur 14 Tage nach dem Absetzen gemessen und es wäre von Interesse, die Metaboliten über einen längeren Zeitraum nach dem Absetzen zu messen, um festzustellen, ob diese Veränderungen das Ergebnis langfristiger Stoffwechselveränderungen mit der Einstellung der Milchaufnahme sind oder , alternativ kurzfristige Stoffwechselanpassungen oder eine Folge der akuten Stressreaktion.

Der starke und anhaltende Anstieg der zirkulierenden Glukose von W im Vergleich zu NW-Kälbern könnte so interpretiert werden, dass er einen Anstieg der Glukoneogenese widerspiegelt, entweder aufgrund der Stressreaktion oder aufgrund von Stoffwechselanpassungen, um mehr Energie aus flüchtigen Pansenfettsäuren und glukoneogenen AA statt aus Milch zu produzieren, oder beide. Einerseits fördern Glukokortikoide den Glukogenstoffwechsel bei Stress durch die Mobilisierung von Glykogenspeichern in Leber und Muskeln45,49,50,51. Das Cortisol- und Stressverhalten erreichte jedoch am Tag 2 nach dem Absetzen seinen Höhepunkt und kehrte am Tag 7 auf die Werte vor dem Absetzen zurück, wohingegen die Glukose in der vorliegenden Studie am Tag 14 ihren Höhepunkt erreichte. Andererseits nimmt die Geschwindigkeit der Gluconeogenese mit dem Übergang vom Vorwiederkäuer- zum Wiederkäuerstadium zu1. Alle Kälber der vorliegenden Studie ernährten sich von Weide mittlerer Qualität und daher wurde erwartet, dass der Glukosegehalt in der Nahrung minimal ist. Die Gluconeogenese in der Leber kann durch aus dem Pansen absorbiertes Propionat, Laktose, Laktat und glucogene AA wie Alanin und Glutamin1 sowie Valin, Isoleucin und Threonin47 unterstützt werden. Alanin, Valin und Threonin schienen in der vorliegenden Studie die Gluconeogenese unterstützt zu haben und stiegen wie Glucose auf d 14 an. Propionat wurde in den NMR-Spektren nicht identifiziert, obwohl Acetat an Tag 7 und 14 einen starken Anstieg zeigte. Laktat, Glutamin und Isoleucin zeigten jedoch keine Unterschiede zwischen W- und NW-Kälbern an Tag 7 oder Tag 14.

Acetat ist ein VFA, das in größerem Anteil bei der Fermentation von Futter mit hohem Futteranteil im Pansen entsteht und dort in den Blutkreislauf aufgenommen wird52. Daher könnte die größere Menge an Acetat bei W-Kälbern im Vergleich zu NW-Kälbern an Tag 7 und Tag 14 auf eine höhere Futter- und Ballaststoffaufnahme bei W-Kälbern (die teilweise Milch ersetzt) zurückzuführen sein. Nach der Absorption kann Acetat in 3-Hydroxybutyrat umgewandelt, über den Tricarbonsäurezyklus (TCA) oxidiert oder zur Fettsäuresynthese verwendet werden53. Allerdings erreichte die Konzentration von Acetat in der vorliegenden Studie nicht gleichzeitig mit der von 3-Hydroxybutyrat ihren Höhepunkt.

Der zeitliche Trend von 3-Hydroxybutyrat von W-Kälbern in der vorliegenden Studie war interessant, da er am 2. Tag seinen Höhepunkt erreichte, aber bis zum 14. Tag erhöht blieb. Dieser Metabolit kann entweder aus einer unvollständigen Oxidation von Fettsäuren während der Lipolyse oder der Umwandlung von Acetat während der Absorption stammen der Pansen54. Daher ist es möglich, dass die bei W-Kälbern beobachteten Trends beide Stoffwechselprozesse widerspiegeln, wobei in den ersten beiden Tagen nach dem Absetzen eine größere Menge an 3-Hydroxybutyrat vorliegt, was auf die unvollständige hepatische Oxidation von Fettsäuren (NEFA) zurückzuführen ist, die während der akuten Stressreaktion mobilisiert wurde. Die relative Häufigkeit von 3-Hydroxybutyrat könnte dann durch die Umwandlung von im Pansen absorbiertem Acetat aufgrund der erhöhten Futteraufnahme aufrechterhalten worden sein. Dies wird durch Ergebnisse früherer Studien gestützt, die zeigten, dass 3-Hydroxybutyrat in Zeiten mit hohem Energiebedarf oder negativer Energiebilanz bei postpartalen Milchkühen oder Kälbern nach Transport und Entwöhnung anstieg37,55,56. Es ist wichtig zu beachten, dass der relative Beitrag verschiedener Stoffwechselwege zu den beobachteten Trends und der Häufigkeit zirkulierender Metaboliten mit dem experimentellen Design der vorliegenden Studie nicht gemessen werden kann. Es ist auch möglich, dass andere Metaboliten ebenfalls die Wechselwirkung zwischen mehreren Stoffwechselwegen widerspiegeln, wie beispielsweise Glukose, Kreatin, Phenylalanin, Glutamat und 3-Hydroxyisobutyrat.

Kreatin, Kreatinphosphat und Kreatinin der W-Kälber unterschieden sich am 14. Tag maximal von denen der NW-Kälber. Diese Metaboliten sind für den Energiestoffwechsel des Wiederkäuers von entscheidender Bedeutung, um Energie zu speichern und zu recyceln. Erhöhte Kreatinkinase, Kreatin und Kreatinin sind mit übermäßigem Muskelabbau und Muskelschäden in Zeiten erhöhter oder ungewohnter körperlicher Aktivität und Stress verbunden45,46,47. Kreatin ist eine der Hauptenergiequellen für Gehirngewebe und Skelettmuskeln bei körperlicher Aktivität. Kreatin wird durch das Enzym Kreatinkinase in Kreatinphosphat umgewandelt und als reichhaltige Energiequelle gespeichert47. Diese Reaktion ist reversibel und somit kann Kreatinphosphat in Kreatin umgewandelt werden, um Energie (ATP) zu erzeugen, und Kreatin kann dann in einer irreversiblen Reaktion in Kreatinin umgewandelt werden, das ein inaktives Endprodukt des Muskelstoffwechsels ist, das mit dem Urin ausgeschieden wird47,57. Aus diesem Grund wird Kreatinin oft als Indikator für Proteolyse und Körpermuskelmasse verwendet und nimmt typischerweise im Blut ab, gleichzeitig mit einem Anstieg von 3-Hydroxybutyrat und NEFA und mit einer Verringerung der Glukose bei postpartalen Milchkühen, die aufgrund einer negativen Energiebilanz BW verlieren58, 59. Diese bei Milchkühen beobachteten Veränderungen stehen jedoch im Gegensatz zu den Ergebnissen bei entwöhnten Kälbern der vorliegenden Studie, bei denen alle drei Metaboliten nach dem Absetzen bis zum Tag 14 anstiegen. Die W-Kälber der vorliegenden Studie zeigten unmittelbar nach dem Absetzen an Tag 1 und Tag 2 eine erhöhte körperliche Aktivität, die jedoch an Tag 7 und Tag 14 abnahm, was mit früheren Studien übereinstimmt9,19. Daher scheint die erhöhte Menge an Kreatin und Kreatinin bei W-Kälbern bis zum Tag 14 nicht durch körperliche Aktivität, Verhaltensindikatoren für Stress, Cortisol oder NEFA erklärt zu werden. Es könnte möglich sein, dass die Produktion von Kreatin und die Speicherung von Kreatinphosphat nach einer Phase akuten Stresses oder hoher körperlicher Aktivität fortgesetzt werden, was zu einem „chronischen“ Anstieg dieser Metaboliten führt. Diese letztere Hypothese kann jedoch mit den Daten der vorliegenden Studie nicht bestätigt werden, und es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um festzustellen, ob solche tiefgreifenden und langfristigen Veränderungen im Energie- und Proteinstoffwechsel das Ergebnis eines früheren akuten Stresses sind, der zu einem chronischen Anstieg von Kreatin und Kreatinin führte zu Stoffwechselveränderungen aufgrund der Unterbrechung der Milchaufnahme. Unabhängig davon schienen sich W-Kälber bis zum 14. Tag in einer katabolen Situation befunden zu haben, wobei sowohl Proteolyse als auch Lipolyse auftraten, was sich in hohen relativen Konzentrationen von Kreatin, Kreatinin, 3-Hydroxybutyrat, Glucose und etwas AA widerspiegelte.

Allantoin stieg in der vorliegenden Studie am Tag 7 und am Tag 14 bei W-Kälbern im Vergleich zu NW-Kälbern an. Allantoin ist eines der Purinderivate, das mit dem Fluss von mikrobiellem Protein aus dem Pansen und mit der OM-Aufnahme zunimmt60, außerdem ist es am Harnstoffzyklus beteiligt und wird im Urin ausgeschieden47. Darüber hinaus wurde Allantoin als Biomarker für chronischen oxidativen Stress, Krankheiten und Seneszenz sowohl bei Rindern als auch bei Menschen vorgeschlagen61,62. Chronischer Stress war in der vorliegenden Studie nicht erkennbar, und es wird vermutet, dass die höhere Allantoinkonzentration von W im Vergleich zu Kälbern aus NW auf die höhere Aufnahme von festem Futter und die mikrobielle Aktivität im Pansen nach Absetzen der Milchaufnahme zurückzuführen ist. Die Futteraufnahme wurde in der vorliegenden Studie jedoch nicht gemessen und daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um diese Hypothese zu bestätigen. Ebenso sind die Gründe für den anhaltenden Anstieg von Valin, Alanin, Threonin, Leucin, Lysin, Phenylalanin und Glutamat bei W-Kälbern bis zum Tag 14 in der vorliegenden Studie schwer zu erklären, da die Gesamtproteinaufnahme nicht gemessen wurde (sowohl aus Milch als auch aus der Weide). . Die fäkale N-Konzentration, die an denselben Tagen der Blutentnahme als Indikator für die Proteinaufnahme gemessen wurde, zeigte zu keinem Zeitpunkt Unterschiede zwischen W- und NW-Kälbern mit einem Gesamtdurchschnitt von 1,12 ± 0,033 und 1,15 ± 0,032 % der Trockenmasse für W- und NW-Kälber. bzw. (Daten nicht gezeigt; P > 0,05). Dies könnte darauf hindeuten, dass sich der Gesamtproteinfluss zum unteren Magen-Darm-Trakt zwischen W- und NW-Kälbern nicht unterschied.

Frühere Untersuchungen zur Messung von Metaboliten im Blut wurden an mit Milchaustauschern gefütterten Kälbern durchgeführt, die nicht wie in der vorliegenden Studie dem Stress durch die Trennung vom Muttertier ausgesetzt waren. Darüber hinaus wurde die Milchmenge in den meisten früheren Studien mit Milchkälbern63 und Fleischkälbern64 schrittweise reduziert, und diese Studien wurden in kleinen Ställen durchgeführt, in denen die Tiere ihr Stressverhalten, beispielsweise das Gehen über weite Strecken, nicht vollständig zum Ausdruck bringen konnten. Beispielsweise zeigte das Absetzen der Fütterung von Milchaustauschern keine Auswirkungen auf Glukose oder NEFA im Blut64,65 und erhöhte Glukose, Acetat, Propionat und Butyrat sowie eine Abnahme von NEFA63. Interessanterweise stieg der 3-Hydroxybutyrat in allen oben genannten Studien nach dem Absetzen an, und es besteht Übereinstimmung, dass dieser Metabolit aus der Umwandlung von Acetat und Butyrat im Pansenepithel infolge einer größeren Aufnahme von festem Futter stammt, das im Pansen entwöhnter Kälber fermentiert wurde63. Eine Studie mit Mastkälbern auf der Weide, die beim Absetzen in Ställen untergebracht wurden, ergab ähnliche Ergebnisse wie die vorliegende Studie, bei der sowohl NEFA als auch 3-Hydroxybutyrat nach dem Absetzen anstiegen, obwohl Glukose und Kreatinkinase im Gegensatz zur vorliegenden Studie nicht beeinträchtigt wurden3. Es ist wichtig zu beachten, dass es in der letztgenannten Studie keine Kontrollgruppe im Nordwesten wie in der vorliegenden Studie gab. Eine Überprüfung der Auswirkungen der Entwöhnung auf Kälber kam zu dem Schluss, dass die zirkulierende Glukose in allen Studien zu inkonsistenten Ergebnissen führte, die Ursachen für diese Diskrepanzen jedoch nicht identifiziert wurden2.

Die vorliegende Studie bestätigte, dass die Blutmetabolomik eine starke Plattform zur Untersuchung und zum Verständnis von Stoffwechselveränderungen darstellt, die aus komplexen Wechselwirkungen resultieren, die durch Stress und Ernährungsumstellungen entstehen. Die Kombination aus 1H-NMR mit hohem Durchsatz und erweiterter Statistik ist eine leistungsstarke Kombination, die eine große Menge an biologischen Informationen generiert. Das Gebiet der Metabolomik kann einen wichtigen Beitrag dazu leisten, das Verständnis komplexer Stoffwechselveränderungen zu verbessern. Dies könnte die Entwicklung von Strategien erleichtern, die das Management, die Leistung und das Wohlergehen von Nutztieren verbessern. Beispielsweise könnten Nahrungsergänzungsmittel für Kälber beim Absetzen mit einer hohen Konzentration an Vorläufern der für die Gluconeogenese oder die Stressreaktion erforderlichen Metaboliten wie Tyrosin formuliert werden. Darüber hinaus könnte der Nährstoffbedarf entwöhnter Kälber mithilfe neuer Technologien gesteuert werden, um gezielte Mengen und Arten von Nahrungsergänzungsmitteln bereitzustellen66. Diese Ansätze können auch in Strategien integriert werden, die die körperliche Aktivität reduzieren, wie z. B. Entwöhnung vom Hof, Zaunkontakt oder zweistufige Entwöhnung, die bekanntermaßen die Stressreaktion und den Energieverbrauch senkt8,9.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mehrere wichtige Metaboliten bei Kälbern bis zum 14. Tag nach dem Absetzen dramatische Veränderungen zeigten, was deutliche Veränderungen im Kohlenhydrat-, Lipid- und Proteinstoffwechsel aufgrund von Stress und Ernährungsumstellung widerspiegelt. Stressbedingte Stoffwechselveränderungen schienen nur von kurzer Dauer zu sein und waren am 2. Tag nach dem Absetzen am stärksten ausgeprägt, wohingegen längerfristige Stoffwechselveränderungen bis zum 14. Tag nach dem Absetzen beobachtet wurden. Die drastischen kurzfristigen Veränderungen im Lipidstoffwechsel von W-Kälbern spiegelten sich in einem starken Anstieg von NEFA und Betain als Methyldonor zur Erleichterung der Lipidoxidation wider. Der Metabolit 3-Hydroxybutyrat schien sowohl an kurz- als auch langfristigen Veränderungen des Lipidstoffwechsels beteiligt zu sein, der am Tag 2 seinen Höhepunkt erreichte und bis zum Tag 14 nach dem Absetzen hoch blieb. Langfristige Veränderungen im Lipidstoffwechsel zeigten sich durch niedrigere Konzentrationen von LDL/VLDL und ungesättigten Lipiden, die am Tag 14 nach dem Absetzen am deutlichsten waren und das Ergebnis einer Ernährungsumstellung aufgrund des Absetzens der Milchaufnahme sein könnten. Die wichtigste metabolische Veränderung im Zusammenhang mit dem Kohlenhydratstoffwechsel war der signifikante Anstieg der Glukosekonzentration im Plasma von W-Kälbern bis zum 14. Tag, der auf eine Zunahme der Glukoneogenese zurückzuführen sein könnte. Darüber hinaus könnte ein an den Tagen 7 und 14 beobachteter starker Anstieg des Acetats auf eine stärkere Fermentation des festen Futters im Pansen zurückzuführen sein, was möglicherweise auch zu einer anhaltend hohen Häufigkeit von 3-Hydroxybutyrat bei W-Kälbern beigetragen hat. Veränderungen im Proteinstoffwechsel wurden durch einen Anstieg mehrerer AA und Allantoin bis zum 14. Tag nachgewiesen. Schließlich spiegelten sich tiefgreifende langfristige Veränderungen im Energiestoffwechsel von peripherem Muskel- und Gehirngewebe in einem starken Anstieg der relativen Konzentration von zirkulierendem Kreatin, Kreatin, wider Phosphat und Kreatinin bei W-Kälbern bis zum Tag 14. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, ob es sich bei den langfristigen Stoffwechselveränderungen von Kälbern nach dem Absetzen um eine dauerhafte Stoffwechselveränderung oder eine vorübergehende Veränderung aufgrund von akutem oder chronischem Stress handelt und ob die Metabolitenkonzentrationen Rückkehr zu den Werten vor dem Absetzen.

Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor verfügbar.

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Wir danken Dr. Ian Luck für seine fachkundige Beratung zur 1H-NMR und Herrn P. Lipscombe, Frau J. Lipscombe und Frau S. Steedman für das Management und die Pflege der Tiere. Wir danken außerdem Dr. Augusto Imaz für die Erstellung der Zahlen, Herrn Allan Lisle für seine statistische Beratung und dem emeritierten Professor Alan Bell für konstruktive Kommentare zu einer frühen Version des Papiers. JGSC wurde vom CNPq Science Without Borders Program (Brasilien) unterstützt und BCK wurde von der CAPES Foundation (Bildungsministerium Brasiliens) unterstützt, Prof. Luciano A. Gonzalez wurde vom McCaughey Memorial Trust und dem Vermächtnis von Nancy Roma Paech unterstützt. Die Studie wurde teilweise durch das Vermächtnis von Nancy Roma Paech an Prof. Michael J. D'Occhio finanziert.

Die Studie wurde durch das Vermächtnis von Nancy Roma Paech, dem McCaughey Memorial Trust und der University of Sydney finanziert.

Sydney Institute of Agriculture und School of Life and Environmental Sciences, Fakultät für Naturwissenschaften, The University of Sydney, Camden, NSW, 2570, Australien

Luciano A. Gonzalez, Julia GS Carvalho, Bruno C. Kuinchtner und Michael J. D'Occhio

Abteilung für Tierreproduktion, Fakultät für Veterinärmedizin und Tierwissenschaften, Universität São Paulo, São Paulo, SP, Brasilien

Julia GS Carvalho & Pietro S. Baruselli

Labor für natürliche Weideökologie (LEPAN), Bundesuniversität Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasilien

Bruno C. Kuinchtner

Kolling Institute of Medical Research, Northern Medical School, University of Sydney, St. Leonards, NSW, 2065, Australien

Anthony C. Dona

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JGSC: Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Schreiben – Originalentwurf; BCK, ACD, Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; PSB: Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; MJD: Konzeptualisierung, Methodik, Finanzierungseinwerbung, Untersuchung, Methodik, Projektverwaltung, Ressourcen, Aufsicht, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; LAG, Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Methodik, Aufsicht, Schreiben – Originalentwurf.

Korrespondenz mit Luciano A. González.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

González, LA, Carvalho, JGS, Kuinchtner, BC et al. Die Plasma-Metabolomik zeigt große Veränderungen im Kohlenhydrat-, Lipid- und Proteinstoffwechsel von abrupt entwöhnten Mastkälbern. Sci Rep 13, 8176 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35383-2

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Eingegangen: 07. April 2023

Angenommen: 17. Mai 2023

Veröffentlicht: 20. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35383-2

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