Der Einfluss einer Vitamin-D3-Supplementierung auf das fäkale und orale Mikrobiom von Milchkälbern im Stall oder auf der Weide

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9111 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Vitamin D (VitD) entwickelt sich neben seiner etablierten Rolle im Stoffwechsel und der Mineralstoffhomöostase auch zu einem Immunregulator. Ziel dieser Studie war es herauszufinden, ob VitD in vivo das orale und fäkale Mikrobiom bei Holstein-Friesian-Milchkälbern moduliert. Das Versuchsmodell bestand aus zwei Kontrollgruppen (Ctl-In, Ctl-Out), die mit einer Diät gefüttert wurden, die 6000 IU/kg VitD3 im Milchaustauscher und 2000 IU/kg im Futter enthielt, und zwei Behandlungsgruppen (VitD-In, VitD-Out) mit 10.000 IU/kg VitD3 im Milchaustauscher und 4000 IU/kg im Futter. Eine Kontroll- und eine Behandlungsgruppe wurden nach dem Absetzen im Alter von etwa 10 Wochen ins Freie gebracht. Speichel- und Stuhlproben wurden nach 7-monatiger Supplementierung gesammelt und die Analyse des Mikrobioms mittels 16S-rRNA-Sequenzierung durchgeführt. Die Bray-Curtis-Unähnlichkeitsanalyse ergab, dass sowohl der Ort der Probenahme (oral vs. fäkal) als auch die Unterbringung (drinnen vs. draußen) einen signifikanten Einfluss auf die Zusammensetzung des Mikrobioms hatten. Die im Freien gehaltenen Kälber wiesen eine größere mikrobielle Diversität in den Kotproben auf, basierend auf Observed-, Chao1-, Shannon-, Simpson- und Fisher-Messungen im Vergleich zu in Innenräumen gehaltenen Kälbern (P < 0,05). Eine signifikante Wechselwirkung zwischen Unterbringung und Behandlung wurde für die Gattungen Oscillospira, Ruminococcus, CF231 und Paludibacter in Stuhlproben beobachtet. Die Gattungen Oscillospira und Dorea waren nach der VitD-Supplementierung in den Stuhlproben vermehrt, während Clostridium und Blautia vermindert waren (P < 0,05). Eine Wechselwirkung zwischen VitD-Supplementierung und Unterbringung wurde in der Häufigkeit der Gattungen Actinobacillus und Streptococcus in den oralen Proben festgestellt. Eine VitD-Supplementierung erhöhte die Gattungen Oscillospira, Helcococcus und reduzierte die Gattungen Actinobacillus, Ruminococcus, Moraxella, Clostridium, Prevotella, Succinivibrio und Parvimonas. Diese vorläufigen Daten legen nahe, dass eine VitD-Supplementierung sowohl das orale als auch das fäkale Mikrobiom verändert. Nun werden weitere Untersuchungen durchgeführt, um die Bedeutung mikrobieller Veränderungen für die Gesundheit und Leistung der Tiere zu ermitteln.

Infektionskrankheiten wirken sich erheblich auf die wirtschaftliche Nachhaltigkeit von Milchsystemen aus, und die jährliche Frühsterblichkeit kann durchschnittlich fast 10 % der Kälber ausmachen, wobei die Raten in einigen landwirtschaftlichen Betrieben deutlich höher sind1. Darüber hinaus beeinträchtigt die Krankheit die Fähigkeit weiterer Kälber, die Produktionsziele zu erreichen und ihr genetisches Potenzial auszuschöpfen. Atemwegs- und Darmbakterien und Viren (Respiratory Syncytial Virus, BVD, Herpesvirus, E. coli, Rotavirus, Salmonellen) sind für die Mehrzahl der Infektionskrankheiten verantwortlich, die junge Milchkälber betreffen2,3. Ein schlecht angepasster Start ins Leben kann weiterhin die Produktivität von Rindern beeinträchtigen und im späteren Leben zu einer Krankheitsanfälligkeit beitragen2. Um den Wohlergehensbedürfnissen insbesondere von Milchkälbern besser gerecht zu werden und unsere Abhängigkeit von Antibiotika zur Behandlung bakterieller Infektionen zu verringern, sind daher kontinuierliche Anstrengungen erforderlich, um die natürliche Krankheitsresistenz und die Gesundheit des Tieres optimal zu stärken.

Im frühen Leben verlassen sich Kälber zum Schutz vor Krankheiten überwiegend auf ihr angeborenes Immunsystem, da sich der adaptive Arm ihres Immunsystems allmählich bis zur Reife etwa sechs Monate nach der Geburt entwickelt4. Ein wesentlicher Faktor für die optimale Vorbereitung des adaptiven Immunsystems und die Entwicklung der Homöostase ist die Etablierung des Mikrobioms. Es wird angenommen, dass die ersten Starterkulturen für die mikrobielle Entwicklung aus direkt nach der Geburt aufgenommenem Kolostrum stammen, obwohl neuere Forschungsergebnisse darauf hindeuten, dass eine gewisse Exposition bereits in der Gebärmutter erfolgen kann5. Das Neugeborene ernährt sich ausschließlich von Milch und es wird angenommen, dass die Kolonisierung des Darms im Ileum beginnt und sich anschließend im gesamten sich entwickelnden Prä-Wiederkäuer-Trakt etabliert6,7. Die Zusammensetzung der Darmflora wurde bei jungen Kälbern ermittelt und es wurde über ein Vorherrschen von Firmicutes berichtet. Bei der Entwicklung des Pansens und der Entstehung homöostatischer Regulationsmechanismen im Gewebe kommt es jedoch zu erheblichen dynamischen Veränderungen in der mikrobiellen Abfolge8.

Die Unterstützung der Etablierung eines vielfältigen Mikrobioms gilt heute als Schlüsselelement für die Förderung einer optimalen Entwicklung des Immunsystems und der optimalen Etablierung der Homöostase. Tatsächlich geht man davon aus, dass ein vielfältiges Mikrobiom ein Hauptschutzmerkmal gegen eindringende Krankheitserreger ist9, und Faktoren, die zur Polarisierung oder Verringerung der Diversität des Mikrobioms beitragen (sogenannte Dysbiose), sind ein wesentlicher Krankheitsrisikofaktor. Eine aktuelle Studie am Menschen hat gezeigt, dass eine Vitamin-D-Supplementierung (VitD) die mikrobielle Diversität im Darm deutlich erhöht. Insbesondere stieg das Verhältnis von Bacteroidetes zu Firmicutes, zusammen mit der Häufigkeit der gesundheitsfördernden probiotischen Taxa Akkermansia und Bifdobacterium10. Das orale Mikrobiom hat in der Forschung weniger Beachtung gefunden als das Darmmikrobiom, aber Studien haben eine Fülle von Familien, darunter Neisseriaceae, Streptococcaceae und Pasteurellaceae sowie Moraxellaceae, in der oralen Mikrobiota identifiziert11, aber die Auswirkungen von VitD auf die relative Häufigkeit dieser Populationen bleiben unbekannt. Eine VitD-Supplementierung bietet möglicherweise einen Mechanismus zur Unterstützung der Entwicklung des Immunsystems bei jungen Milchkälbern. Die Rolle von VitD bei der Regulierung des Mikrobioms bei Rindern wurde jedoch bisher nicht untersucht.

VitD ist für die meisten Säugetiere ein lebenswichtiges Steroid. Die beiden häufigsten Formen von VitD sind Ergocalciferol (Vit D2) und Cholecalciferol (Vit D3). Ergocalciferol wird aus dem pflanzlichen Steroid Ergosterol gewonnen, während Cholecalciferol in der Haut produziert wird, wenn sie UVB-Strahlen der Sonne ausgesetzt wird12. Rinder können VitD durch Hautsynthese und Nahrungsquellen (Heu, Silage, Milchaustauscher usw.) erhalten. Der Gehalt an Vit D2 in Silage ist oft sehr unterschiedlich und grünes Gras ist eine schlechte Quelle für Vit D2; Somit stammt bei grasenden Wiederkäuern fast das gesamte VitD aus der dermalen Synthese. Obwohl Vit D3 in Futterkonzentraten enthalten ist, führen Unterschiede in den Haltungspraktiken zu Schwankungen im VitD-Status von Rindern zwischen den Betrieben und im Laufe des Jahres13.

Unsere Arbeit hat kürzlich gezeigt, dass die zirkulierenden VitD-Werte bei im Frühjahr geborenen Milchkälbern nicht optimal sind14 und dass niedrige Werte mit erheblichen zeitlichen Veränderungen der systemischen Immunität, einschließlich Immunzellpopulationen und der Expression von Immunproteinen, einschließlich des Chemokins Interleukin, verbunden sind 815. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass eine Ergänzung mit diesem Mikronährstoff das orale und fäkale Mikrobiom von Holstein-Friesian-Milchkälbern erheblich verändern würde. Unter Verwendung desselben VitD-Supplementierungsmodells bestand das Ziel dieser Studie darin, die in der Mundhöhle und im Stuhl vorhandenen Mikrobenpopulationen zu charakterisieren, die sich als Reaktion auf eine VitD-Supplementierung über die Nahrung verändern können.

Die zirkulierenden VitD-Konzentrationen unterschieden sich deutlich zwischen den für die Mikrobiomsequenzierung verwendeten Gruppen (P < 0,05, Abb. 1). Um sicherzustellen, dass keine negativen Auswirkungen auf das Wachstum oder das Wohlergehen der Tiere auftreten, wurden diese Parameter während des gesamten Experiments überwacht. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen in Bezug auf die Krankheitshäufigkeit (P > 0,05). Obwohl die Ctl-Out-Gruppe am Ende des Experiments eine Tendenz zu niedrigeren Endgewichten zeigte, wurden weder beim Anfangsgewicht noch bei der Körpergewichtszunahme signifikante Unterschiede festgestellt (P > 0,05; ergänzende Abbildung S1).

Zirkulierende Konzentrationen von 25OHD-Spiegeln im Serum von Holstein-Friesian-Kälbern in jeder Gruppe. Boxplots und individuelle Kälberkonzentrationen der Serum-25OHD-Spiegel bei Kälbern (ng/ml) innerhalb jeder Gruppe (n = 6) werden mit statistischer Signifikanz angezeigt, die als *p < 0,05 angegeben ist. Kälber waren eine Untergruppe einer größeren Studie, die zuvor von Flores-Villalva et al.14 veröffentlicht wurde.

Das fäkale und orale Mikrobiom der Kälber unterschied sich signifikant (P < 0,05), basierend auf der Permanova-Analyse und durch Visualisierung mithilfe der Bray-Curtis-Distanzmatrix und mehrdimensionaler Skalierung (Abb. 2). In Bezug auf die Alpha-Diversität waren die Stuhlproben basierend auf Observed-, Chao1- und Shannon-Messungen vielfältiger als orale Proben (P < 0,05) (Daten nicht gezeigt). Der Unterschied in der Zusammensetzung wurde durch die Unterschiede auf Stammebene noch deutlicher (Abb. 3). Das fäkale Mikrobiom wies im Vergleich zum oralen Mikrobiom einen signifikanten Anstieg der Firmicutes (94 % vs. 56 %), aber weniger Fusobakterien (< 1 % vs. 9 %) und Proteobakterien (< 1 % vs. 23 %) auf.

Hauptkomponentenanalyse (PC) basierend auf mehrdimensionaler Skalierung und Bray-Curtis-Distanzmatrix. Die Analyse unterstreicht die klare Unterscheidung zwischen Kot- und Mundproben bei Holstein-Friesian-Kälbern. N = 22 Kälber pro Gruppe.

Zusammensetzung des fäkalen und oralen Mikrobioms auf Stammebene, gruppiert nach Behandlung und Unterbringung. Diese Daten veranschaulichen den Unterschied zwischen dem oralen und fäkalen Mikrobiom bei Holstein-Friesian-Kälbern. N = 4–6 Kälber pro Gruppe.

Das fäkale Mikrobiom wurde von der Familie Ruminococcaceae dominiert (durchschnittlich > 70 %), gefolgt von Lachnospiraceae (15 %), Clostridiaceae (3 %), Peptostreptococcaceae (2 %) und Rikenellaceae (1 %). 1 % (Ergänzungstabelle S1). Auf Gattungsebene war Oscillospira (durchschnittlich 30 %) die dominierende Gattung mit Faecalibacterium (11 %), Dorea (10 %), Ruminococcus (6 %), Prevotella (5 %), CF231 (5 %), Clostridium (3 %). und Blautia (2%) stehen im Vordergrund (Ergänzungstabelle S1).

VitD hatte in der aktuellen Studie keinen Einfluss auf die Messung der Alpha-Diversität (Tabelle 1). Allerdings hatte die Unterbringung einen erheblichen Einfluss auf die Beta-Diversität im fäkalen Mikrobiom (P < 0,05), basierend auf der Permanova-Analyse und durch Visualisierung mithilfe der Bray-Curtis-Distanzmatrix und mehrdimensionaler Skalierung (Abb. 4). Die im Freien gehaltenen Kälber wiesen eine größere Diversität auf, basierend auf Observed-, Chao1-, Shannon-, Simpson- und Fisher-Messungen im Vergleich zu in Innenräumen gehaltenen Kälbern (Tabelle 1; P < 0,05).

Hauptkomponentenanalyse (PCA) basierend auf mehrdimensionaler Skalierung und Bray-Curtis-Distanzmatrix. Die Analyse verdeutlicht den Unterschied zwischen in Innen- und Außenhaltung gehaltenen Kälbern in Kotproben von Holstein-Friesian-Kälbern. N = 12 Kälber pro Gruppe.

Signifikante Auswirkungen auf die Differentialhäufigkeitsanalyse in den Stuhlproben sind in Tabelle 2 dargestellt, während die vollständigen Analyseergebnisse in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt sind. Es gab keinen signifikanten Einfluss der VitD-Supplementierung oder keine Wechselwirkung zwischen VitD-Supplementierung und Wohntyp auf das fäkale Mikrobiom auf Stamm- oder Familienebene (Ergänzungstabelle S1). Die Familien Peptostreptococcaceae, Rikenellaceae und Ruminococcaceae waren bei Kälbern, die im Freien gehalten wurden, vermehrt, während die in Innenräumen gehaltenen Kälber vermehrt Lachnospiraceae und Prevotellaceae aufwiesen (Tabelle 2; P < 0,05).

Bei den Gattungen Ruminoccocus, CF231 Paludibacter und Oscillospira gab es eine Wechselwirkung zwischen Unterbringung und Behandlung (Tabelle 2; P < 0,05). Bei der Gattung Ruminococcus gab es eine Wechselwirkung zwischen Unterbringung und Behandlung, wobei eine VitD-Supplementierung Ruminococcus im Freien erhöhte, während bei in Innenräumen gehaltenen Kälbern keine Wirkung festgestellt wurde. Es gab eine Wechselwirkung zwischen Haltung und Behandlung für die Gattung CF231, wobei eine VitD-Supplementierung CF231 in der Innenhaltung erhöhte, während eine VitD-Supplementierung diese Gattung verringerte, wenn die Kälber im Freien waren. Es gab eine Wechselwirkung zwischen Haltung und Behandlung der Gattung Paludibacter, ohne dass bei den in Innenräumen gehaltenen Kälbern ein Effekt festgestellt wurde, während die VitD-Supplementierung im Freien Paludibacter signifikant reduzierte. Es gab eine größere Reaktion auf die VitD-Supplementierung bei der Gattung Oscillospira bei Kälbern in Innenhaltung im Vergleich zu Kälbern im Freien, bei denen die Supplementierung keine Wirkung hatte. Unabhängig vom Haltungstyp kam es nach der VitD-Supplementierung zu einem Anstieg der Gattungen Dorea, während Clostridium und Blautia abnahmen (P < 0,05). Bei in Innenräumen gehaltenen Kälbern war die Konzentration von Faecalibacterium, Blautia, Prevotella und Succinivibrio erhöht, während 5-7N15 im Vergleich zu im Freien gehaltenen Kälbern reduziert war (P < 0,05).

Das orale Mikrobiom war beeinträchtigt durch Ruminococcaceae (32 %), Pasteurellaceae (17 %), Lachnospiraceae (10 %), Fusobacteriaceae (6 %), Leptotrichiaceae (5 %), Neisseriaceae (3 %), Moraxellaceae (2 %), Peptostreptococcaceae (2). %), Clostridiaceae (2 %), Tissierllaceae (2 %), Flavobacteriaceae (2 %), Mycoplasmataceae (2 %) und Weeksellaceae (2 %) (Durchschnittswerte aus den in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführten Daten). Auf Gattungsebene war das orale Mikrobiom durch Actinobacillus (19 %), Fusobacterium (12 %), Moraxella (5 %), Ruminococcus (4 %), Faecalbacterium (4 %), Clostridium (4 %) und Oscillospira (4 %) beeinträchtigt. , Dorea (3 %), Ornithobacterium (3 %), Helococcus (2 %) und Blautia (1 %), wobei andere Gattungen mit einer Häufigkeit von weniger als 1 % identifiziert wurden.

Die Diversitätsmaße wurden in den mündlichen Proben nicht beeinflusst (Ergänzungstabelle S2). Signifikante Auswirkungen auf die Differentialhäufigkeitsanalyse in den oralen Proben sind in Tabelle 3 dargestellt, während die vollständigen Analyseergebnisse in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt sind. Es gab eine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Unterbringung der Stämme Firmicutes und Proteobacteria (P < 0,05). Eine VitD-Supplementierung verringerte Firmicutes bei in Innenräumen gehaltenen Kälbern, während Firmicutes bei im Freien gehaltenen Kälbern erhöht war. Es gab eine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Unterbringung der Stamm-Proteobakterien, wobei eine VitD-Supplementierung die Proteobakterien in Innenräumen vermehrte, während im Freien keine Wirkung festgestellt wurde. Mit VitD ergänzte Kälber wiesen im Vergleich zu Kälbern, denen kein zusätzliches VitD verabreicht wurde, vermehrt Bacteroidetes auf (P < 0,05). Die Phyla Fusobacteria und Actinobacteria waren reduziert, während Tenericutes und Cyanobacteria bei Kälbern im Freien im Vergleich zu Kälbern in Innenräumen zunahmen (Tabelle 3).

Bei den Familien Pasteurellaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae und Neisseriaceae gab es eine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Unterbringung (Tabelle 3). Eine VitD-Supplementierung in Innenräumen steigerte die Zahl der Pasteurellaceae stärker als bei Kälbern im Freien. Eine VitD-Supplementierung in Innenräumen verringerte die Zahl der Lachnospiraceae, während im Freien keine Wirkung festgestellt wurde. Es gab eine Wechselwirkung zwischen der VitD-Supplementierung und der Unterbringung bei der Familie der Streptococcaceae, die bei den in Innenräumen gehaltenen Kälbern erhöht und bei den im Freien gehaltenen Kälbern verringert war. Die VitD-Supplementierung verringerte die Familie der Neisseriaceae bei Kälbern im Freien, während diese Gattung bei Kälbern im Stall nicht beeinträchtigt wurde. Eine VitD-Supplementierung erhöhte die Zahl der Flavobacteriaceae, während Leptotrichiaceae und Moraxellaceae bei Kälbern, die kein VitD erhielten, niedriger waren (P < 0,05; Tabelle 3). Beim Vergleich von im Freien gehaltenen Kälbern mit Kälbern in Innenräumen waren Leptotrichiaceae, Fusobacteriaceae, Weeksellaceae und Corynebacteriaceae bei in Innenräumen gehaltenen Kälbern höher, während Mycoplasmataceae im Vergleich zu Kälbern in der VitD-Freilandgruppe reduziert war (P < 0,05; Tabelle 3).

Es gab eine Wechselwirkung zwischen VitD-Supplementierung und Unterbringung in der Häufigkeit der Gattungen Actinobacillus, Streptococcus und Dorea (P < 0,05; Tabelle 3). Eine Nahrungsergänzung in Innenräumen erhöhte Actinobacillus in einem größeren Ausmaß als bei Kälbern im Freien (P < 0,05). Die Wechselwirkung zwischen VitD-Ergänzung und Unterbringung der Gattung Streptococcus zeigte, dass die Ergänzung Streptokokken in der Innenhaltung erhöhte, während es bei Kälbern im Freien keine Wirkung gab. Im Fall von Dorea reduzierte die VitD-Supplementierung die Gattung im Innenbereich, während sie bei Kälbern im Freien zunahm (P < 0,05). Eine VitD-Supplementierung reduzierte die Gattungen Ruminococcus, Moraxella, Succinivibrio, Prevotella und Clostridium, während Flavobacterium unabhängig vom Haltungstyp erhöht war (P < 0,05; Tabelle 3). Beim Vergleich von Kälbern im Freien mit Kälbern im Innenstall wiesen Kälber im Freien mehr Moraxella, Flavobacterium, Sphingomonas und Oscillospira auf, während Kälber im Stall mehr Streptococcus, Fusobacterium, Ruminococcus und Ornithobacterium aufwiesen (P < 0,05; Tabelle 3).

Eine ausreichende VitD gilt heute als entscheidend für eine optimale Gesundheit. Untersuchungen haben ergeben, dass wichtige Zusammenhänge zwischen der 25OHD-Blutkonzentration und der Immunfunktion bestehen. VitD wirkt als Aktivator des angeborenen Immunsystems, um die Reaktion auf Infektionen zu verstärken. VitD stimuliert die mikrobizide Kapazität der angeborenen Zellen gegen Krankheitserreger, indem es die Expression antimikrobieller Proteine fördert, die intrazelluläre Ionenkonzentration senkt und die Autophagie fördert16,17. Wir haben kürzlich gezeigt, wie exogenes VitD die Abtötung von Mykobakterien in peripheren Blutzellen von Kälbern fördert18. Darüber hinaus reguliert VitD die Aktivität des adaptiven Immunsystems, wobei die Wirkung üblicherweise als Hemmung der Th1-Reaktion und Förderung der Th2-Zelldifferenzierung beschrieben wird. Daher begrenzt VitD die Entwicklung einer übermäßigen Entzündungsreaktion19. Der zirkulierende VitD-Spiegel bei im Frühjahr geborenen Milchkälbern ist bei der Geburt mangelhaft und bis etwa zum fünften Lebensmonat nicht optimal14,20. Es werden zunehmend Zusammenhänge zwischen dem Mikrobiom und der Gesundheit des Wirts bei Kälbern festgestellt21 und aufgrund des intrinsischen Zusammenhangs zwischen der Immunfunktion und dem Mikrobiom bedarf der Einfluss der VitD-Supplementierung auf das Mikrobiom des Kalbes weiterer Untersuchungen. Unsere früheren Arbeiten bildeten eine wichtige Grundlage für die Charakterisierung der altersbedingten Entwicklung des Mikrobioms8 und hier identifizieren wir die Vielfalt und Zusammensetzungsveränderungen, die mit der VitD-Supplementierung verbunden sind. Der Zusammenhang zwischen VitD und dem Mikrobiom war Gegenstand mehrerer neuerer Studien (wie von Tangestani et al.22 besprochen). Obwohl die Wirkungsmechanismen Gegenstand laufender Analysen sind, wurde vermutet, dass VitD die Expression von Wirtsabwehrpeptiden im Darm hochregulieren und die Expression von Tight-Junction-Proteinen über die Modulation von VDR verändern könnte, das in Darmgeweben weit verbreitet ist10. Ziel dieser Studie war es daher, die in der Mundhöhle und im Kot vorhandenen Mikrobenpopulationen zu charakterisieren, die sich als Reaktion auf die Nahrungsergänzung mit VitD in zwei verschiedenen Haltungsbedingungen verändern können.

In dieser Studie machten Firmicutes über 90 % des fäkalen Mikrobioms aus, während das orale Mikrobiom aus ~ 55 % Firmicutes, ~ 20 % Proteobakterien, ~ 10 % Fusobakterien und ~ 5 % Bacteroidetes bestand. Dies stimmte teilweise mit früheren Erkenntnissen überein, bei denen Firmicutes die dominierende Phyla in Kotproben von Kälbern war8,11. In der Studie von Klein-Jöbstl et al.23 war Ruminococcaceae die dominierende Familie im fäkalen Mikrobiom von Kühen, was mit der aktuellen Studie übereinstimmt. Allerdings waren in der Studie von Barden et al.11 Proteobakterien die am häufigsten vorkommenden Phyla in den oralen Proben, während hier Firmicutes am häufigsten vorkamen. Es bestehen auch Ähnlichkeiten zwischen dem aktuellen Datensatz und früheren Studien, da Familien wie Pasteurellaceae und Moraxellaceae ebenfalls in großen Mengen in oralen Kälberproben auftraten11. In der Studie von Owens et al.24 dominierten Proteobakterien das orale Mikrobiom, während Bacteroidetes im fäkalen Mikrobiom von Kälbern dominierte. Das Alter der Kälber ist wahrscheinlich ein wesentlicher Faktor, der zur Divergenz zwischen den Berichten in der Literatur mit Probenentnahmen im Alter von 28 Tagen11 bis 60 Tagen24 und der aktuellen Studie, in der die Kälber 230 Tage alt waren, beiträgt.

Es gab mehrere interessante Veränderungen im Zusammenhang mit VitD auf das fäkale Mikrobiom und insbesondere Auswirkungen, die je nach Haltungstyp unterschiedlich waren. Es gab eine größere Reaktion auf die VitD-Supplementierung bei der Gattung Oscillospira bei in Innenräumen gehaltenen Kälbern im Vergleich zu im Freien gehaltenen Kälbern, bei denen die Supplementierung keine Wirkung hatte. Der gegenteilige Trend wurde bei Ruminococcus festgestellt, wobei eine VitD-Supplementierung eine Wirkung hatte, wenn die Kälber draußen, aber nicht drinnen gehalten wurden. Oscillospira baut Pflanzenzellwände ab und nimmt bei der Fütterung von frischem Futter zu25,26,27. Zuvor wurde gezeigt, dass Oscillospira häufiger bei Ochsen auf der Weide vorkommt als bei Ochsen in Innenräumen27. Als die Ernährung von der Weidehaltung auf die Fütterung in Innenräumen umgestellt wurde, verringerte sich die Häufigkeit von Oscillospira, was einen klaren Zusammenhang mit der Weidehaltung unterstreicht27. Dies erklärt dann den Unterschied zwischen in Innen- und Außenhaltung gehaltenen Kälbern in Bezug auf das Mikrobiom, der wahrscheinlich mit Unterschieden in der angebotenen Ernährung zusammenhängt. Im Fall von Ruminococcus war diese Gattung in Innenräumen nicht betroffen, konnte aber nach der VitD-Supplementierung im Freien um über 6 % vermehrt werden. Ruminococcus hat eine ähnliche Funktionalität wie Oscillospira und ist am Abbau von Futtermitteln beteiligt. Innerhalb des Firmicutes-Stamms und der Lachnospiraceae-Familie war Dorea unabhängig vom Haltungstyp vermehrt, während Blautia reduziert war. Dorea ist aktiv am Zellulose- und Hemizelluloseabbau beteiligt und wird mit einer verbesserten Darmgesundheit bei neugeborenen Wiederkäuern und einem erhöhten ADG28,29,30 in Verbindung gebracht. Blautia steht in Zusammenhang mit der Propionatproduktion nach der Stärkefermentation und wurde auch mit einer verbesserten ADG bei Kälbern in Verbindung gebracht31,32. Auch die Gattung Clostridium wurde nach der VitD-Supplementierung reduziert. Clostridium enthält Arten, die bei Kälbern Krankheiten verursachen, insbesondere C.perfringens und C.difficile33. Diese Veränderungen deuten auf insgesamt positive Auswirkungen auf das Darmmikrobiom nach einer VitD-Supplementierung hin.

In dieser Studie werden taxonomische Unterschiede mit der VitD-Supplementierung in Verbindung gebracht, der Grund für die Wechselwirkung zwischen VitD und dem Mikrobiom ist jedoch noch unklar. Obwohl noch nicht vollständig bestätigt, scheint es, dass die Auswirkungen auf das Mikrobiom in dieser Studie kein direkter Einfluss sind, sondern vielmehr eine Wirkung nach der Aufnahme des Mikronährstoffs. In früheren Studien wurde bereits nachgewiesen, dass VitD im Pansen stabil ist, kein Abbau festgestellt wird und die Absorption im Dünndarm erfolgt34. Darüber hinaus hatte VitD in einer In-vitro-Kuhstudie keinen Einfluss auf die Fermentationsparameter im Pansen35. Dies deutet darauf hin, dass der Einfluss von VitD auf das Mikrobiom möglicherweise durch eine Modifikation des Wirts erfolgt, wahrscheinlich durch die Interaktion zwischen dem Mikrobiom und dem Wirt am Darmepithel. Dieser Einfluss von VitD auf den Wirt, insbesondere die Immunität des Wirts, wurde in einer Studie hervorgehoben, die an derselben Gruppe von Kälbern durchgeführt wurde14. Kälber, die in Innenräumen mit VitD3 ergänzt wurden, wiesen im Vergleich zu mit Kontrolltieren gefütterten Kälbern weniger zirkulierende Neutrophile, Eosinophile und Basophile auf14. Zuvor wurde nachgewiesen, dass die Genetik des Wirts das Mikrobiom von Wiederkäuern beeinflusst, da sowohl Roseburia als auch Oscillospira mit SNPs assoziiert waren, die die Immunität und den Stoffwechsel des Wirts regulieren, was in dieser Studie einen möglichen Weg für VitD zur Beeinflussung des Mikrobioms darstellt36. In dieser Studie wurden die Kälber entweder drinnen mit Grassilage oder draußen auf der Weide aufgezogen. Dies könnte die Unterschiede in der Wirkung von VitD erklären, da Haltungspraktiken bekanntermaßen den VitD-Metabolismus beeinflussen37. Tatsächlich wurde in Studien an Menschen und Mäusen ein Zusammenhang zwischen VitD und dem Mikrobiom hergestellt38,39. Interessanterweise waren in der aktuellen Studie auch zwei Familien (Ruminococcaceae und Lachnospiraceae), die im Wildtyp häufiger vorkommen als Mäuse, die kein 1,25(OH)2D340 produzieren können, von VitD betroffen. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden, insbesondere durch direkte Probenentnahme aus den verschiedenen Regionen des Verdauungstrakts, anstatt Stuhlproben als Stellvertreter zu verwenden.

In den oralen Proben kam es innerhalb des Proteobacteria-Stamms zu einer Wechselwirkung zwischen der VitD-Supplementierung und der Unterbringung der Gattung Actinobacillus, wobei VitD dieses Taxon in Innenräumen um 15 %, im Freien jedoch nur um 6 % erhöhte. Im gleichen Stamm wurden Moraxella und Succinivibrio nach der VitD-Supplementierung unabhängig von der Unterbringung reduziert. Mehrere Actinobacillus-Arten werden mit der Entstehung der Krankheit Actinobacillosis (Holzzunge) in Verbindung gebracht. Daher ist der Anstieg dieses Taxons nach einer VitD-Supplementierung überraschend, da VitD mit einer verbesserten Tiergesundheit zusammenhängt. Im Gegensatz dazu wurden die Gattungen Moraxella und Succinivibrio nach einer VitD-Supplementierung reduziert. Moraxella steht im Zusammenhang mit Augeninfektionen durch Moraxella Bovis41. Im Stamm der Firmicutes und in der Ordnung Clostridia gab es mehrere Gattungen, die von VitD beeinflusst wurden. Es gab eine Wechselwirkung zwischen Haltung und VitD bei der Gattung Dorea, die bei in Innenräumen gehaltenen Kälbern reduziert war, im Freien jedoch zunahm, was sich von der Wirkung unterscheidet, die im Kot beobachtet wurde, wo eine Nahrungsergänzung die Gattung Dorea sowohl im Innen- als auch im Außenbereich vermehrte. Ein Effekt, der von Vorteil sein könnte, ist die Reduzierung der Gattung Clostridium, die nach der VitD-Supplementierung reduziert wurde. Clostridium ist eine Gattung, von der bekannt ist, dass sie eine Reihe von Arten enthält, die bei Kälbern Krankheiten verursachen, insbesondere C.perfringens und C.difficile33. Interessanterweise war Clostridium auch in den Stuhlproben reduziert. Im Gegensatz zur Reduzierung von Clostridium kam es jedoch nach der Ergänzung mit VitD zu einer Zunahme der Gattung Streptococcus. Streptococcus ist eine Gattung, von der bekannt ist, dass sie eine Reihe pathogener Bakterien wie Streptococcus bovis42 enthält. Auch hier ist die Tatsache, dass VitD diese Gattung vermehrt, überraschend. Weitere Untersuchungen müssen durchgeführt werden, um den Einfluss dieser identifizierten Veränderungen auf das Kalb zu untersuchen.

Während das Hauptziel dieser Studie darin besteht, die Auswirkungen der VitD-Supplementierung in zwei verschiedenen Haltungstypen (drinnen vs. draußen) zu bewerten, ist es auch von Interesse, das Mikrobiom der im Innen- und Außenbereich gefütterten Kälber unabhängig von der Supplementierung zu vergleichen. Die Beta-Diversitätsanalyse wird verwendet, um Zusammensetzungsunterschiede zwischen den Probentypen zu bestimmen, und zeigte eine klare Unterscheidung zwischen den Haltungstypen in den Stuhlproben, jedoch keinen Unterschied in den oralen Proben. Es gibt zahlreiche Faktoren, die tatsächlich diesen Unterschied zwischen in Innenräumen gehaltenen Kälbern und im Freien gehaltenen Kälbern verursachen und das Mikrobiom beeinflussen könnten. Indoor- und Outdoor-Gruppen wurden bis zur Entwöhnung etwa am 70. Tag auf ähnliche Weise gemanagt. Nach diesem Zeitpunkt blieb die Innengruppe drinnen und wurde nach Belieben mit Grassilage und Heu gefüttert, während die andere Gruppe nach draußen gebracht wurde und weidendes Gras angeboten bekam. Diese Ernährungsunterschiede sind wahrscheinlich der dominierende Faktor für die festgestellten Veränderungen im Mikrobiom. Unterschiede in der Alpha-Diversität wurden in den Kotproben festgestellt, wobei im Freien gehaltene Kälber eine erhöhte Diversität aufwiesen, basierend auf allen untersuchten Diversitätsmaßen, ohne Unterschied in den oralen Proben. Interessanterweise deutet dies auf erhebliche Veränderungen in der Taxa-Häufigkeit, der Taxa-Reichtum und der Gleichmäßigkeit hin. Eine erhöhte Bakterienvielfalt ist mit einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber Umwelteinflüssen43 und einer verbesserten Darmgesundheit44 verbunden. Da die Auswirkungen der Wohnsituation nicht im Vordergrund dieser Studie standen, gibt es mehrere Faktoren, die nicht kontrolliert wurden, wie z. B. die Ernährung und die Umwelt, die sich auf das Mikrobiom auswirken könnten, aber eine zukünftige detailliertere Studie ist erforderlich, um den Einfluss der Wohnart auf die Wohnsituation zu ermitteln das Kälbermikrobiom. Darüber hinaus deuten die Endgewichte der Kälber in jeder Gruppe darauf hin, dass Ctl-Out-Kälber ein geringeres Körpergewicht haben, obwohl dieser Unterschied nicht signifikant ist. Für zukünftige Studien wird es von Bedeutung sein, zu untersuchen, ob die VitD-Supplementierung das Kälberwachstum in einer größeren Kohorte von Kälbern unterstützt.

Die Sterblichkeit und Morbidität von Neugeborenen ist nach wie vor ein erhebliches Problem für die Milchindustrie3 und die Managementsysteme müssen angepasst werden, um negative Tierschutzmaßnahmen und antibiotikaabhängige Praktiken zu reduzieren. Ernährungsstrategien zur Unterstützung einer optimalen Entwicklung des Immunsystems könnten vielversprechend sein, um diese Verluste zu reduzieren, insbesondere bei intensiv gehaltenen Milchkälbern. Es ist bekannt, dass mehrere Faktoren die VitD3-Hautsynthese regulieren, darunter Breitengrad, Höhe und Zeitpunkt der Sonneneinstrahlung45. Diese vorläufige Analyse legt nahe, dass eine VitD-Supplementierung das Mikrobiom bei Kälbern erheblich verändert. Die antimikrobielle und immunregulatorische Rolle von VitD bietet möglicherweise eine kostengünstige und wirksame Ergänzung zur Stärkung der Immunfunktion im Kalb46 und die Auswirkungen auf das orale und fäkale Mikrobiom in dieser Studie bieten einen interessanten Bereich für weitere Untersuchungen zu Fermentation, Nährstoffverdaulichkeit und Gesundheit. Diese Veränderungen in den Mikrobenpopulationen können dazu beitragen, die Krankheitsresistenz von Milchkälbern zu erhöhen.

Die in dieser Studie verwendeten Tiere waren Teil der von Flores-Villalva et al.14 beschriebenen Studie und werden im Folgenden kurz beschrieben. An dem Experiment nahmen 48 Holstein-Friesian-Bullenkälber mit einem Durchschnittsgewicht von 42 kg aus einem einzigen Betrieb teil, die zwischen Februar und März 2020 geboren wurden. Bei dem Experiment handelte es sich um ein randomisiertes vollständiges Blockdesign mit einer zwei-mal-zwei-faktoriellen Anordnung der Behandlungen, wobei die Kälber nach dem Zufallsprinzip einer von vier Behandlungen zugewiesen wurden (n = 12). Die Behandlungen wurden als faktorielles Design mit zwei Vitamin-D3-Diäten (Ctl und VitD) und zwei Bedingungen für den Zugang zu Sonnenlicht (drinnen = drinnen oder draußen = draußen) angeordnet. Für die Ctl-Diäten wurden ein handelsüblicher Milchaustauscher (MR) mit 6000 IU/kg VitD3 und ein handelsübliches Pellet mit 2000 IU/kg VitD3 verwendet. Für die VitD3-Diäten wurden MR und Pellet mit VitD3 ergänzt, um 10.000 IU/kg bzw. 4000 IU/kg VitD3 zu erreichen. Daher waren die vier Behandlungen mit jeweils 12 Kälbern: Ctl-In: im Stall und 6000 IU/kg im MR + 2000 IU/kg VitD3 im Futter; VitD-In: Im Innenbereich und 10.000 IE/kg im MR + 4.000 IE/kg VitD3 im Futter; Ctl-Out: Im Freien und 6000 IU/kg im MR + 2000 IU/kg VitD3 im Futter; VitD-Out: Im Freien und 10.000 IU/kg im MR + 4000 IU/kg VitD3 im Futter. Der Milchaustauscher wurde bis zur Entwöhnung gefüttert, danach erfolgte die Ergänzung ausschließlich über das Futter. Eine Analyse der Zusammensetzung von handelsüblichem Milchaustauscher und handelsüblichen Pellets finden Sie in den ergänzenden Daten. Nach dem Absetzen wurden die Tiere vom 70. Tag bis zum 230. Tag am Ende des Versuchs gefüttert. Die Kälber wurden zu Beginn des Experiments und anschließend am Tag 70, Tag 130, Tag 160 und Tag 230 gewogen. Zu Beginn des Experiments wurde allen Kälbern eine einzelne Injektion von 50.000 IE VitD3 subkutan verabreicht, mit Ausnahme von Ctl-In, das eine Vehikelinjektion mit Ethanol erhielt. Das VitD3 wurde aus Trockenpulverkonzentrat (Rovimix D3 500, DSM Nutritional Products) mit 500.000 IE pro Gramm VitD3 durch Zugabe von 0,5 g des Konzentrats zu destilliertem Wasser hergestellt. Die Nahrungsergänzungsmittel wurden wöchentlich frisch zubereitet und bei 4 °C gelagert. Dem MR wurden einmal täglich Nahrungsergänzungsmittel zugesetzt und nach dem Absetzen wurden die Pellets darüber verteilt.

Alle Kälber wurden in Gruppen im Teagasc Animal and Bioscience Research Centre, Co. Meath, Irland, gehalten. Nach dem Absetzen im Alter von 70 Tagen wurden durchschnittliche Freilandgruppen (Ctl-Out, VitD-Out) auf Weideflächen gebracht und von Mai bis Oktober abwechselnd beweidet. Indoor-Gruppen (Ctl-In, VitD-In) wurden während der Versuchsdauer in Gefangenschaft gehalten und erhielten Heu und Silage nach Belieben. Die Analyse der 25OHD-Serumkonzentrationen erfolgte im Rahmen einer früheren Studie14. Im Verlauf des Experiments wurden Anzeichen einer Atemwegs- oder Magen-Darm-Erkrankung registriert; Es wurden jedoch keine Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet. Ein Kalb ging verloren, dies stand jedoch nicht im Zusammenhang mit experimentellen Behandlungen. Das Gewicht jedes Kalbes wurde bei der Geburt und am Ende des Versuchs aufgezeichnet und ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Um den Einfluss der VitD3-Supplementierung und der Haltungsart auf das Mikrobiom zu untersuchen, wurden nach 230 Tagen der Supplementierung von sechs Kälbern pro Behandlungsgruppe Abstriche aus dem bukkalen Bereich des Mundes und aus dem Rektum entnommen. Die Tupfer wurden in den Mund oder das Rektum eingeführt, dreimal im Uhrzeigersinn gedreht und in Röhrchen mit PBS-Puffer aufbewahrt und in Trockeneis überführt. Anschließend wurden die Abstriche bis zur Analyse bei –80 °C gelagert.

Die Extraktion der bakteriellen DNA aus den fäkalen und oralen Abstrichen und die anschließende Hochdurchsatzsequenzierung der hypervariablen Region V3–V4 des bakteriellen 16S-rRNA-Gens wurden auf einer Illumina MiSeq-Plattform gemäß ihren Standardprotokollen (Eurofins Genomics, Ebersberg, Deutschland) durchgeführt. und wie zuvor beschrieben47. Die V3–V4-Region wurde mit Universalprimern PCR-amplifiziert, wobei Adapter einschließlich Nukleotidsequenzen für Vorwärts- und Rückwärtsindexprimer aufgenommen wurden. Die Amplikon-Reinigung wurde mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) durchgeführt und für die Index-PCR unter Verwendung von Nextera XT-Indexprimern (Illumina, San Diego, CA, USA) vorbereitet48. Der Reinigungsschritt wurde an den indizierten Proben mit AMPure XP-Perlen wiederholt und mit einem Fragmentanalysator (Agilent, Santa Clara, CA, USA) bewertet. Im Anschluss an diesen Schritt wurde ein Pool aus gleichen Mengen jeder Versuchsprobe erstellt. Die Bibliothek wurde dann mit dem Bioanalyzer 7500 DNA-Kit (Agilent) analysiert und unter Verwendung der V3–V4-Chemie (2 × 300 bp Paired-End-Reads) sequenziert.

Quantitative Insights into Microbial Ecology (Qiime) wurde verwendet, um die Sequenzierungsdaten zu untersuchen49. Sequenzierungsprimer wurden mit dem Cutadapt-Paket entfernt und die resultierenden Paired-End-Reads wurden mit der Paired-End-Reads-Funktion in Qiime unter Verwendung der Standardkriterien zusammengeführt. Das Demultiplexen von Paired-End-Rohlesevorgängen erfolgte über die Split-Libraries-Funktion und die Qualitätsfilterung wurde unter Verwendung von Standard-QIIME-Parametern durchgeführt. Es wurden nur Lesevorgänge beibehalten, die keine mehrdeutigen Zeichen, keine nicht genauen Barcode-Übereinstimmungen, eine Sequenzlänge > 225 Nukleotide und einen Lesequalitätswert von > 27 enthielten. Die uclust-Funktion in Qiime wurde verwendet, um OTUs basierend auf einer Sequenzähnlichkeit von 97 % auszuwählen. Singletons wurden entfernt, da nur OTUs, die auf der Ebene von mindestens zwei Lesevorgängen in mehr als einer Probe vorhanden waren, erhalten blieben, während chimäre Sequenzen mit ChimeraSlayer50,51 entfernt wurden. Die GreenGenes-Datenbank ordnete OTUs verschiedenen taxonomischen Ebenen zu. Eine Kombination aus der mormalisierten OTU-Tabelle, experimentellen phänotypischen Daten und dem phylogenetischen Baum wurde kombiniert, um das Phyloseq-Objekt für die weitere Analyse zu erstellen (http://www.r-project.org; Version 3.5.0, abgerufen am 25. März). Die Dynamik von Reichtum und Diversität in der Mikrobiota wurde mit den beobachteten Indizes Chao1, Shannon, Simpson und Fisher berechnet. Die Simpson- und Shannon-Diversitätsindizes berücksichtigen sowohl die Parameter der Fülle als auch der Gleichmäßigkeit. Die Beta-Diversitätsmessungen sind ein Maß für die Trennung der phylogenetischen Struktur der OTU in einer Probe im Vergleich zu allen anderen Proben. Dies wurde durch Normalisierung der Daten geschätzt, sodass die Anzahl taxonomischer Merkmale in allen Proben vergleichbar war. Zur Berechnung der Distanzmatrix der verschiedenen mehrdimensionalen Reduktionsverfahren wurden mehrere Distanzmetriken berücksichtigt. Dazu gehörten gewichtete/ungewichtete UniFrac-Distanz- und nicht-phylogenetische Distanzmetriken (z. B. Bray-Curtis-, Jensen-Shannon-Divergenz und Euclidian) unter Verwendung von Phyloseq in R52,53. Tests zur unterschiedlichen Häufigkeit wurden an Tabellen durchgeführt, die aus dem Phyloseq-Objekt auf Stamm-, Familien- und Gattungsebene extrahiert wurden. Die Daten wurden mit dem PROC Glimmix-Verfahren innerhalb der Statistical Analysis Software (SAS) 9.4 (SAS, 2013) analysiert. Das Modell bewertete die Haupteffekte der Behandlung (Strg vs. VitD) und der Unterbringung (innen vs. draußen) und die damit verbundene Interaktion, wobei das einzelne Kalb die Versuchseinheit darstellte. Für die statistische Analyse der relativen Bakterienhäufigkeit wurden 6 Kälber pro Behandlungsgruppe verwendet, mit Ausnahme der VitD-In-Gruppe in den oralen Proben, die aufgrund unzureichender DNA in den Abstrichen nur vier Proben enthielt. Die Ergebnisse werden unter Verwendung der von Benjamini-Hochberg (BH) angepassten P-Werte dargestellt.

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Teagasc-Ethikkommission (TAEC237-2019) genehmigt und unter der experimentellen Lizenz (AE19132/P105) der Regulierungsbehörde für Gesundheitsprodukte in Übereinstimmung mit dem Tierquälereigesetz (Irland 1876) und der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt 2010/63/EU. Die Berichterstattung im Manuskript folgt den Empfehlungen in den ARRIVE-Richtlinien.

Die 16S-rRNA-Gensequenzdaten wurden im European Nucleotide Archive (ENA) unter der Studienzugangsnummer PRJEB56677 hinterlegt.

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Die Finanzierung der Studie erfolgte über ein Stipendium der Science Foundation Ireland an Kieran Meade (17/CDA/4717). SFV dankt Conacyt Mexico auch für das bereitgestellte Doktorandenstipendium.

School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Irland

S. Vigors, S. Flores-Villalva & KG Meade

CENID Physiologie, INIFAP, Querétaro, Mexiko

S. Flores-Villalva

Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Irland

KG Meade

Institut für Lebensmittel und Gesundheit, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Irland

S. Vigors & KG Meade

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Konzeption und Design der Studie, Design der Experimente: SFV, SV und KM. Durchführung der Experimente: SFV und SV. Datenanalyse: SV. Verfassen und Bearbeiten des Papiers: SFV, SV und KM. Interpretation der Ergebnisse: alle Autoren. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit KG Meade.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vigors, S., Flores-Villalva, S. & Meade, KG Der Einfluss der Vitamin-D3-Supplementierung auf das fäkale und orale Mikrobiom von Milchkälbern im Stall oder auf der Weide. Sci Rep 13, 9111 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34840-2

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Eingegangen: 19. Oktober 2022

Angenommen: 09. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34840-2

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