Eine Eisenüberladung in der Nahrung verstärkt die durch westliche Ernährung verursachte Leberentzündung und verändert den Lipidstoffwechsel bei Ratten, die Ähnlichkeiten mit menschlichem DIOS aufweisen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21414 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine Eisenüberladung in der Leber geht häufig mit einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) einher. Das dysmetabolische Eisenüberladungssyndrom (DIOS) ist durch einen Anstieg der Eisenspeicher in Leber und Körper sowie der Komponenten des metabolischen Syndroms gekennzeichnet. Zunehmende Hinweise deuten auf eine Überschneidung zwischen NAFLD mit Eisenüberladung und DIOS hin; Der Mechanismus, wie Eisen an ihrer Pathogenese beteiligt ist, bleibt jedoch unklar. Hier untersuchten wir die Rolle von Eisen in der Pathologie eines Rattenmodells von NAFLD mit Eisenüberladung. Ratten, die 26 Wochen lang eine westliche Diät (fettreich und fruktosereich) erhielten, wiesen eine Lebersteatose mit erhöhtem Körpergewicht und Dyslipidämie auf. Die Hinzufügung einer Eisenüberladung in der Nahrung zur westlichen Ernährung führte zu einem weiteren Anstieg der Serumtriglyceride und des Cholesterins und verstärkte Leberentzündungen; Die betroffene Leber wies eine starke Eisenablagerung in den Sinusmakrophagen/Kupffer-Zellen auf, die mit einer nuklearen Translokation von NFκB und einer Hochregulierung von Th1/M1-bezogenen Zytokinen verbunden war. Das vorliegende Modell wäre nützlich, um den Mechanismus zu untersuchen, der der Entwicklung und dem Fortschreiten von NAFLD sowie DIOS zugrunde liegt, und um die wichtige Rolle von Eisen als einem der „Multiple Hits“-Faktoren aufzuklären.

Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist heute weltweit die häufigste Ursache chronischer Lebererkrankungen. Es ist stark mit dem metabolischen Syndrom (MetS) verbunden, einschließlich Fettleibigkeit, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM), Dyslipidämie und Bluthochdruck. Die Prävalenz von NAFLD in der Weltbevölkerung wird auf 25 % geschätzt, mit einem stetigen Anstieg im letzten Jahrzehnt aufgrund der gestiegenen Zahl von MetS-Patienten1,2. Bei den meisten Patienten besteht eine Anreicherung von Triglyceriden in der Leber mit minimaler hepatozellulärer Schädigung und Entzündung (einfache Steatose oder nichtalkoholische Fettleber [NAFL]), während bei einigen Patienten eine Ansammlung von Triglyceriden in der Leber mit stärkerer hepatozellulärer Schädigung und Entzündung (nichtalkoholische Steatohepatitis; NASH) vorliegt, die fortschreiten kann zu Leberfibrose/Zirrhose und schließlich zum hepatozellulären Karzinom (HCC). Epidemiologische Studien schätzen, dass die NASH-Prävalenz bei biopsierten NAFLD-Patienten bzw. bei nicht biopsierten NAFLD-Patienten 59 % bzw. 6,7 bis 30 % beträgt, wobei 0,5 % von ihnen zu HCC1 fortschreiten.

Obwohl durch intensive Bemühungen einige Therapeutika für NAFLD gefunden wurden, die zu einer Verbesserung des Krankheitszustands führen, bleiben größtenteils noch ungelöste Herausforderungen bestehen3. Einer der Hauptgründe für diese Schwierigkeit ist, dass die dem Fortschreiten der NAFLD zugrunde liegende Pathogenese recht komplex und multifaktoriell ist. Eine „Multiple-Hits“-Hypothese, die besagt, dass verschiedene ätiologische Faktoren (z. B. Insulinresistenz, Lipotoxizität, oxidativer Stress, Veränderung der Immunität und Darmdysbiose) während der Entwicklung und des Fortschreitens der Krankheit parallel und synergetisch wirken, wird weitgehend zum Verständnis akzeptiert die Pathogenese von NAFLD4,5. Daher stellt die Etablierung präklinischer Tiermodelle, die das gesamte Spektrum menschlicher NAFLD abbilden, eine große Herausforderung dar, ist jedoch für die Entwicklung wirksamer Therapeutika für NAFLD unbedingt erforderlich6,7.

Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff für den Körper, da es für lebenswichtige biologische Prozesse wie den Sauerstofftransport, die Mitochondrienatmung, die DNA-Synthese und die Zellsignalisierung notwendig ist8,9. Überschüssiges Eisen reichert sich in bestimmten Organen an, einschließlich der Leber, dem Herzen und den endokrinen Drüsen, was durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch die Fenton-Reaktion zu Gewebeschäden führt9. Eine Eisendysregulation, die sich in unangemessen niedrigen Serum-Hepcidin-Spiegeln und Hyperferritinämie äußert, kommt bei chronischen Lebererkrankungen häufig vor, während bei NAFLD über hohe Serum- und Leber-Hepcidin-Spiegel berichtet wurde, da davon ausgegangen wird, dass sowohl Fettleibigkeit als auch Diabetes die Hepcidin-Produktion erhöhen10,11. Bei 30–35 % der NAFLD-Patienten kam es zu einer Eisenanreicherung in der Leber, und mehrere epidemiologische Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen erhöhten Eisenspeichern im Körper und MetS, NAFLD und Insulinresistenz hin12,13,14. Darüber hinaus deuten andere Studien darauf hin, dass das Vorhandensein und Muster der Eisenablagerung in der Leber mit fortgeschrittener Leberfibrose, Hepatozytenschädigung und Steatohepatitis bei NAFLD zusammenhängt12,15,16.

Das dysmetabolische Eisenüberladungssyndrom (DIOS) ist eine Erkrankung, die durch einen Anstieg der körpereigenen Eisenspeicher im Zusammenhang mit verschiedenen Komponenten von MetS definiert ist, ohne dass eine erkennbare Ursache für eine Eisenüberladung vorliegt. Es wird klinisch eine Hyperferritinämie, eine normale oder mäßig erhöhte Transferrinsättigung und das Vorhandensein von MetS-Komponenten diagnostiziert17,18,19,20,21. Es wird angenommen, dass DIOS und NAFLD stark korrelieren; Ungefähr 50 % der DIOS-Patienten leiden an NAFLD, während mehr als 30 % der NAFLD-Patienten an DIOS leiden18,21.

Obwohl neue Erkenntnisse auf einen Zusammenhang zwischen NAFLD, Eisenüberladung und MetS hinweisen, bleiben die Mechanismen, wie Eisen das Fortschreiten dieser Stoffwechselerkrankungen fördert, unklar18. Ein anwendbares Tiermodell mit Eisenüberladung, das die Leber- und Ganzkörperzustände menschlicher NAFLD darstellt, würde es uns ermöglichen, den Einfluss von Eisen auf Stoffwechselerkrankungen zu verstehen. Wir haben zuvor in einem NAFLD22-Rattenmodell eine Zunahme der Leberentzündung mit einer Hochregulierung proinflammatorischer Zytokine durch Nahrungsergänzung mit Eisen gezeigt. Allerdings kam es beim Vorgängermodell nur zu einer leichten Eisenanreicherung in der Leber; Es reicht nicht aus, die Vernetzung zwischen NAFLD und DIOS zu untersuchen. Unseres Wissens gibt es kein etabliertes Modell, das die klinischen und pathologischen Phänotypen sowohl von NAFLD mit Eisenüberladung als auch von DIOS darstellt. Daher zielt diese Studie darauf ab, die pathologische Rolle der Eisenüberladung bei der Pathogenese von NAFLD aufzudecken und sich dabei auf die Frage zu konzentrieren, ob und wie sich die Eisenüberladung als einer der „Multiple-Hits“-Faktoren auf die Krankheit auswirkt, und zwar unter Verwendung eines neuen Tiermodells mit Langzeitbeobachtung Fütterung einer westlichen Diät mit Eisenergänzung.

Ratten der Gruppen mit westlicher Ernährung (WD) und westlicher Ernährung mit hohem Eisengehalt (WD + Fe) zeigten ein erhöhtes Körpergewicht basierend auf einer erhöhten Kalorienaufnahme im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Cont) bzw. der Gruppe mit eisenreicher Ernährung (Fe) ( Abb. 1b, c). Ratten in der Gruppe mit eisenreicher Ernährung (Fe) hatten trotz ihrer höheren Nahrungsaufnahme und Kalorienaufnahme ein geringeres Körpergewicht als die Cont-Gruppe (Abb. 1a – c). Es wurde gezeigt, dass ein erhöhter Appetit bei Nagetieren, die eine eisenreiche Diät erhalten, mit einer vom cAMP-responsiven Elementbindungsprotein (CREB) abhängigen Herunterregulierung von Leptin in Adipozyten verbunden ist23. Das geringere Körpergewicht in der Fe-Gruppe kann mit einer früheren Erkenntnis erklärt werden, dass eine Eisenüberladung durch eine Hochregulierung der AMP-aktivierten Proteinkinaseaktivität im Skelettmuskel und in der Leber positive Auswirkungen auf den Stoffwechsel hat 24. Die Lebern der Cont- und Fe-Gruppen zeigten ein normales Gesamtbild . Andererseits wiesen die Lebern der WD- und WD + Fe-Gruppen eine Hepatomegalie mit diffuser Verfärbung auf (Abb. 1d), was auf eine Fettleber hindeutet. Sowohl das absolute als auch das relative Lebergewicht stiegen in den WD- und WD + Fe-Gruppen im Vergleich zu den Cont- und Fe-Gruppen (absolutes Lebergewicht; P = 0,0055 für WD vs. Cont, P < 0,0001 für WD + Fe vs. Cont, P = 0,0049 für WD). vs. Fe und P < 0,0001 für WD + Fe vs. Fe, relatives Lebergewicht; P = 0,0003 für WD vs. Cont, P < 0,0001 für WD + Fe vs. Cont, P = 0,006 für WD vs. Fe und P < 0,0001 für WD + Fe vs. Fe); Sie waren in der WD + Fe-Gruppe höher als in der WD-Gruppe (absolutes Lebergewicht; P = 0, 0174, relatives Lebergewicht; P = 0, 0025) (Abb. 1e, f). Histologisch wiesen die Lebern der Cont- und Fe-Gruppen keine erkennbare Anomalie auf (Abb. 2a, d, e, h). In den Gruppen WD und WD + Fe wurde eine diffuse mikrovesikuläre Steatose mit vereinzelter makrovesikulärer Steatose beobachtet, wobei der Grad zwischen den beiden Gruppen ähnlich war (Abb. 2b, c, f, g). Die Lipidvakuolen in Hepatozyten der WD- und WD + Fe-Gruppen färbten sich rot mit Ölrot O (Abb. 2i – l). In Übereinstimmung mit der histologischen Steatose stieg der Triglyceridgehalt in der Leber in den Gruppen WD (P < 0,0001 vs. Cont, P = 0,0001 vs. Fe) und WD + Fe (P = 0,0012 vs. Cont, P = 0,0016 vs. Fe) an signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen (Abb. 2m).

Zeitliche Veränderungen in (a) Nahrungsaufnahme, (b) Kalorienaufnahme und (c) Körpergewicht der Kontroll-, WD-, WD + Fe- und Fe-Gruppen. Die Kalorienaufnahme wurde berechnet, indem der Nahrungsverbrauch mit den geschätzten Gesamtkalorien jeder in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Diät multipliziert wurde. (d) Bruttobilder der Lebern der Kontroll-, WD-, WD + Fe- und Fe-Gruppen in Woche 26. Balken: 1 cm. (e) Absolutes und (f) relatives Lebergewicht pro 100 g Körpergewicht in den Kontroll-, WD-, WD + Fe- und Fe-Gruppen in Woche 26. Die Daten werden als Box und Whiskers dargestellt (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont, †P < 0,05 gegenüber WD und §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich.

Histopathologie der Leber in den (a) Kontroll-, (b) WD-, (c) WD + Fe- und (d) Fe-Gruppen in Woche 26. CV: Zentralvene. Balken: 100 µm. (e–h) Jeweils höhere Vergrößerung der Anzeige. Balken: 15 µm. Ölrot O-gefärbte Abschnitte in der Leber der (i) Kontroll-, (j) WD-, (k) WD + Fe- und (l) Fe-Gruppen in Woche 26. Balken: 50 µm. (m) Hepatischer Triglyceridgehalt in Woche 26. Die Daten werden als Box und Whiskers dargestellt (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont und §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich.

Serum- und Lebereisen stiegen in den Gruppen Fe (Serumeisen; P < 0,0001, Lebereisen; P = 0,0071) und WD + Fe (Serumeisen; P = 0,0003, Lebereisen; P = 0,0262) im Vergleich zur Cont-Gruppe (Abb. 3a). , b), verbunden mit einer Hochregulierung von Hepcidin in der Leber (P < 0,0001 für Fe und WD + Fe vs. Cont) (Abb. 3d), dem Hauptregulator der systemischen Eisenhomöostase8,25. Auch das Serumeisen erhöhte sich in der WD-Gruppe im Vergleich zur Cont-Gruppe (P = 0,0025). Die Transferrinsättigung, die die Bindungskapazität des Eisentransporters Transferrin an zirkulierendes freies Eisen25 anzeigt, stieg in der Fe-Gruppe im Vergleich zu den anderen drei Gruppen (P < 0,0001 gegenüber Cont, WD und WD + Fe) (Abb. 3c). Die Transferrinsättigung veränderte sich in den WD- und WD + Fe-Gruppen trotz des erhöhten Serumeisens nicht; Erhöhtes Serumeisen ohne erhöhte Transferrinsättigung ist ein klinisches Merkmal von menschlichem DIOS17,21. Serumferritin, ein weit verbreiteter Marker für die körpereigenen Eisenspeicher beim Menschen25, veränderte sich in allen Gruppen nicht signifikant; Es korrelierte nicht mit den Eisenspeichern in der Leber (ergänzende Abbildung S1a, b), wie an anderer Stelle beschrieben26. Die Eisenfärbung nach Perls zeigte eine Eisenanreicherung in den Sinuszellen und Hepatozyten in den WD + Fe- und Fe-Gruppen im Vergleich zu den Cont- und WD-Gruppen (Abb. 3g – j). Die Eisenanreicherung war in den Sinuszellen stärker als in Hepatozyten sowohl der Fe- als auch der WD + Fe-Gruppe. Die Immunhistochemie in Kombination mit der Eisenfärbung zeigte, dass sich Eisen hauptsächlich in Iba1-positiven Makrophagen/Kupffer-Zellen im Sinusoid ansammelte (Abb. 3k, l). Die Ansammlung von Eisen kann oxidativen Stress auslösen und wurde daher oft als einer der Schlüsselfaktoren für das Fortschreiten der NAFLD angesehen27,28. Der hepatische Gehalt an Malondialdehyd (MDA), einem häufig verwendeten Biomarker für oxidativen Stress (Lipidperoxidation)28, stieg in der WD + Fe-Gruppe (P = 0,0403 vs. WD) (Abb. 3e), während hepatisches Glutathion (GSH)/ Das Verhältnis von oxidiertem Glutathion (GSSG), ein Indikator für das Gleichgewicht zwischen oxidativem Stress und Antioxidantien29, änderte sich nicht signifikant (Abb. 3f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass oxidativer Stress, zumindest auf der gesamten Gewebeebene, in diesem Modell nicht die Hauptrolle bei der Pathogenese der Fettlebererkrankung spielt.

Biochemische Blutdaten von (a) Serumeisen, (b) Lebereisengehalt, (c) Transferrinsättigung und (d) hepatischer Expression von Hepcidin-mRNA in Woche 26. (d) Die Daten wurden auf 18S-rRNA normalisiert und als fache Änderung ausgedrückt aus der Kontrollgruppe. (e) Lebergehalt an Malondialdehyd (MDA) in Woche 26, bestimmt mit der Methode der Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen. (f) Verhältnis des Lebergehalts von Glutathion (GSH)/oxidiertem Glutathion (GSSG) in Woche 26. Die Daten werden als Box und Whiskers dargestellt (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont, †P < 0,05 gegenüber WD und §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich. Bilder der Perls-Eisenfärbung in der Leber der (g) Kontroll-, (h) WD-, (i) WD + Fe- und (j) Fe-Gruppen in Woche 26. Balken; 50 μm. IHC für Iba1 kombiniert mit Perls-Eisenfärbung in den Gruppen (k) WD + Fe und (l) Fe in Woche 26. Pfeilspitzen zeigen die Eisenanreicherung (blau gefärbt) in Iba1-positiven Makrophagen/Kupffer-Zellen (braun gefärbt). Bar; 30 μm.

Die Serumtriglyceride stiegen nur in der WD + Fe-Gruppe an (P = 0,0149 vs. Cont) (Abb. 4a). Das Gesamtcholesterin im Serum erhöhte sich in den Gruppen WD (P < 0,0001 vs. Cont und Fe) und WD + Fe (P < 0,0001 vs. Cont und Fe) im Vergleich zu den Gruppen Cont und Fe; es war in der WD + Fe-Gruppe höher als in der WD-Gruppe (P <0,0001) (Abb. 4b). Die freien Fettsäuren, Glukose und Insulin im Serum unterschieden sich nicht signifikant zwischen allen Gruppen (Abb. 4c – e); Allerdings war der Seruminsulinwert bei einer der vier Ratten der WD + Fe-Gruppe sehr hoch (12.949 pg/ml gegenüber 2107 ± 1698 pg/ml in der Cont-Gruppe). Die alkalische Phosphatase (ALP) im Serum erhöhte sich durch Fütterung mit westlicher Nahrung (P = 0,0185 für WD vs. Cont, P = 0,0014 für WD vs. Fe und P = 0,0093 für WD + Fe vs. Fe) (Abb. 4f). Serum-Aspartat-Aminotransferase und Alanin-Aminotransferase stiegen in den WD- und WD + Fe-Gruppen nicht an und sanken in der Fe-Gruppe (ergänzende Abbildung S2a, b).

Biochemische Blutdaten von (a) Serumtriglycerid, (b) Gesamtcholesterin, (c) freien Fettsäuren, (d) Glukose, (e) Insulin und (f) alkalischer Phosphatase (ALP) in Woche 26. Die Daten werden dargestellt als Box und Whiskers (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont, †P < 0,05 gegenüber WD und §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich.

In der Leber fördert Insulin die Phosphorylierung von Insulinrezeptorsubstraten (IRS1/2) am Tyrosinrest. Wenn IRS1 an Tyr612 phosphoryliert wird, vermittelt es Stoffwechselfunktionen von Insulin wie die Unterdrückung der Gluconeogenese30. Nach der Tyrosinphosphorylierung von IRS1/2 werden Akt-Serin/Threonin-Proteinkinasen, insbesondere Akt2, durch Phosphorylierung aktiviert und unterdrücken dann die Phosphorylierung und nukleare Translokation des Forkhead-Box-Proteins O1 (FOXO1), eines Transkriptionsfaktors, der die Gluconeogenese und Glykogenolyse reguliert30,31 . FOXO1 stimuliert direkt die Transkription von Pck1 und G6pc, den wichtigsten glukoneogenen Lebergenen30,31. Es wird davon ausgegangen, dass MetS-Patienten mit Insulinresistenz möglicherweise eine Hemmung der Tyrosinphosphorylierung von IRS1 aufweisen, was zu einer Herunterregulierung der Akt2-Phosphorylierung führt. Durch die Unterdrückung der Akt2-Aktivierung bleibt FOXO1 im Zellkern, was zu einer anhaltenden oder übermäßigen Aktivierung der hepatischen Glukoneogenese führt32. In dieser Studie unterschied sich die hepatische Expression von Gesamt-IRS1 nicht signifikant zwischen allen Gruppen (Abb. 5a), während die Tyrosinphosphorylierung in IRS1 (Tyr612) bei WD (P = 0,0002 gegenüber Cont und P <0,0001 gegenüber Fe) und WD + abnahm Fe-Gruppen (P = 0,0002 vs. Cont und P = 0,0087 vs. Fe) im Vergleich zu Cont- und Fe-Gruppen (Abb. 5b). Die Expression von Gesamt- und phosphoryliertem Akt2 verringerte sich auch in WD (Gesamt-Akt2; P = 0,0027 vs. Cont und P = 0,0259 vs. Fe, phosphoryliertes Akt2; P = 0,007 vs. Fe) und WD + Fe (Gesamt-Akt2; P = 0,0002 vs . Cont und P = 0,0013 vs. Fe, phosphoryliertes Akt2; P = 0,0272 vs. Cont und P = 0,0002 vs. Fe) (Abb. 5c, d). Die nukleare Translokation von FOXO1 veränderte sich zwischen den vier Gruppen nicht signifikant (Abb. 5e, f). Darüber hinaus war die hepatische Expression der Pck1- und G6pc-Gene in den Gruppen WD und WD + Fe herunterreguliert (ergänzende Abbildung S3a, b). Diese Daten legen nahe, dass der Insulinsignalweg in der Leber der WD- und WD + Fe-Gruppen zumindest teilweise verändert ist.

Hepatische Expression von (a) Gesamt-IRS1, (b) Phospho-IRS1(Tyr 612), (c) Gesamt-Akt2, (d) Phospho-Akt2 aus dem gesamten Lebergewebe-Lysat in Woche 26. Hepatische Expression von FOXO1-Expression im ( e) Zytoplasma- und (f) Kernfraktionen in Woche 26. GAPDH und Histon H2B wurden zur Ladungskontrolle im gesamten Gewebe/Zytoplasma bzw. Kernfraktion verwendet. Die Daten werden als fache Änderung gegenüber der Kontrolle ausgedrückt und als Box und Whiskers dargestellt (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont und §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich.

Die histopathologische Untersuchung ergab eine erhöhte Anzahl von Entzündungsherden im Leberläppchen (Abb. 6a, b) bei WD (P = 0,0011 vs. Cont und P = 0,0011 vs. Fe) und WD + Fe (P < 0,0001 vs. Cont und P). < 0,0001 vs. Fe-Gruppen; die Zahl ist in der WD + Fe-Gruppe viel höher als in der WD-Gruppe (P < 0,0001). Die hepatische Expression von Zytokingenen erhöhte sich bei WD (IL1β; P = 0,0254 vs. Cont, IL10; P = 0,038 vs. Cont) und/oder WD + Fe (TNFα; P = 0,0035 vs. Cont und P = 0,0028 vs. Fe, IFNγ; P = 0,0001 vs. Cont und P = 0,0001 vs. Fe, IL1β; P = 0,0047 vs. Cont, IL10; P = 0,0013 vs. Cont und P = 0,0026 vs. Fe) Gruppen (Abb. 6c–f); Die Expression von TNFα und IFNγ war in der WD + Fe-Gruppe höher als in der WD-Gruppe (TNFα; P = 0,0352, IFNγ; P = 0,0004). Gewebemakrophagen werden funktionell in klassisch aktivierte M1-Typen (mit entzündungsfördernden Eigenschaften) und alternativ aktivierte M2-Typen (mit entzündungshemmenden oder entzündungsfördernden Eigenschaften) eingeteilt33. Die Immunhistochemie ergab, dass die Entzündungsherde in der Leber der WD- und WD + Fe-Gruppen aus iNOS-positiven M1-Makrophagen bestanden; Die Immunreaktivität war in großen Entzündungsherden tendenziell intensiver (Abb. 6g, durch Pfeilspitzen angezeigt) als in kleinen Herden (Mikrogranulom; Abb. 6g, Pfeil) und in WD + Fe intensiver als in der WD-Gruppe (ergänzende Abb. S4a– D). CD206-positive M2-Makrophagen33 wurden sporadisch im Sinusoid beobachtet, ohne direkten Zusammenhang mit Entzündungsherden (Abb. 6h, Pfeil, ergänzende Abb. S4e – f). Die Expression von TNFα-mRNA nahm auch im viszeralen Fettgewebe der WD + Fe-Gruppe zu, verglichen mit den Cont- und WD-Gruppen (ergänzende Abbildung S5a). Die Expression von Leptin im Fettgewebe nahm in den Gruppen WD und WD + Fe ab (ergänzende Abbildung S5b). Die Expression von IL6, Adiponektin und Genen, die am Adipozytenstoffwechsel beteiligt sind (PPARγ, Pde3b, Srebf1, Cpt1a, Acaca und Dgat1), unterschied sich zwischen den Gruppen nicht signifikant (ergänzende Abbildung S5c – j).

(a) Histologische Bilder, die Mikrogranulome (Pfeile) mit mononukleärem Zellinfiltrat in der Fettleber der WD- und WD + Fe-Gruppe darstellen. In den Cont- und Fe-Gruppen kommt es zu keiner bis minimalen Entzündung. (b) Die Anzahl der Entzündungsherde im Leberläppchen in Woche 26. Leberexpression von (c) TNFα, (d) IFNγ, (e) IL1β und (f) IL10-mRNA in Woche 26. Die Daten wurden auf 18S-rRNA normalisiert und als fache Änderung gegenüber der Kontrolle ausgedrückt. Die Daten werden als Box und Whisker dargestellt (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont, †P < 0,05 gegenüber WD und §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich. Bilder von IHC für (g) iNOS und (h) CD206 in der WD + Fe-Gruppe in Woche 26. Pfeile zeigen Mikrogranulome an, während Pfeilspitzen auf große Entzündungsherde hinweisen. Bar; 50 μm.

Um den Mechanismus für die verstärkte Leberentzündung durch die Eisenüberladung in der Nahrung zu klären, wurde in dieser Studie der Kernfaktor Kappa B (NFκB) untersucht, ein Transkriptionsfaktor, der an angeborenen und adaptiven Immunantworten sowie einer Reihe pathologischer Entzündungen beteiligt ist34. Die nukleare Translokation von NFκB aktiviert die Transkription nachgeschalteter Zielgene wie TNFα34. Der NFκB-Spiegel in der Kernfraktion der Leber erhöhte sich in der WD + Fe-Gruppe (P = 0,03 vs. Cont und P = 0,0163 vs. Fe) (Abb. 7a), während sich die zytoplasmatische NFκB-Expression zwischen allen Gruppen nicht signifikant veränderte (Abb. 7b). Als nächstes konzentrierten wir uns auf den Upstream-Weg von NFκB. Der IκB-Kinase (IΚK)-Komplex, bestehend aus zwei Kinasen (IΚKα und IΚKβ), ist der Kernregulator von NFκB. Aktiviertes IΚK phosphoryliert und baut IκB, das Bindungsprotein von NFκB, ab, was zur nuklearen Translokation von NFκB34,35 führt. Phosphoryliertes Akt (einschließlich Akt1 und Akt2) ist über die IΚKα-Phosphorylierung auch als NFκB-Aktivator bekannt36. In dieser Studie gab es zwischen allen Gruppen in unserem Modell keine signifikanten Veränderungen in der hepatischen Expression von phosphoryliertem IΚK (Abb. 7c) und phosphoryliertem Akt (Abb. 7d). Darüber hinaus nahm, wie oben erwähnt, die hepatische Expression von phosphoryliertem Akt2 in der WD + Fe-Gruppe eher ab (Abb. 5d). Die Immunreaktivität von NFκB war sporadisch im Kern von Sinuszellen (wahrscheinlich Kupffer-Zellen) der Cont- und Fe-Gruppen vorhanden (Abb. 7e, h). Eine mäßige bis starke Immunreaktivität wurde im Kern und Zytoplasma von Entzündungszellen in den Mikrogranulomen (Abb. 7f, g; schwarze Pfeile) und großen Entzündungsherden (Abb. 7f, g; schwarze Pfeilspitzen) in den Gruppen WD und WD + Fe beobachtet; Einige Hepatozyten um die Entzündungsherde herum wiesen eine nukleare Immunreaktivität von NFκB auf (Abb. 7f, g; weiße Pfeile).

Hepatische Expression von NFκB in den (a) zytoplasmatischen und (b) Kernfraktionen sowie (c) Phospho-IκB-Kinasen und (d) Phospho-Akt im gesamten Lebergewebe-Lysat in Woche 26. GAPDH und Histon H2B wurden als Ladungskontrolle verwendet in der gesamten Gewebe-/Zytoplasma- bzw. Kernfraktion. Die Daten werden als fache Änderung gegenüber der Kontrolle ausgedrückt und als Box und Whiskers dargestellt (n = 4/Gruppe). *P < 0,05 gegenüber Cont, §P < 0,05 gegenüber Fe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich. Bilder der NFκΒ (p65 oder RelA)-Immunhistochemie in den Gruppen Cont (e), WD (f), WD + Fe (g) und Fe (h). Balken = 50 μm.

NAFLD entwickelt sich in engem Zusammenhang mit MetS, insbesondere mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz, T2DM und Dyslipidämie4. Die westliche Ernährung induzierte im vorliegenden Rattenmodell für NAFLD Lebersteatose, Hyperlipidämie und einen teilweise veränderten hepatischen Insulinweg. Dieses Modell stellt auch eine Leberentzündung mit einer Hochregulierung entzündlicher Zytokine und einer leichten Leberschädigung dar, was auf die Übergangsphänotypen von NAFL zu frühem NASH hinweist. Die Hinzufügung einer Eisenüberladung in der Nahrung zur westlichen Ernährung führte im vorliegenden WD + Fe-Modell zu Hypertriglyceridämie, Hypercholesterinämie, Eisenanreicherung in der Leber, erhöhter Lipidperoxidation in der Leber und einer Verschlimmerung der Leberentzündung mit Hochregulierung von M1-bezogenen Zytokinen und nuklearer Translokation von NFκB. Obwohl es zahlreiche Hinweise darauf gibt, dass ein Eisenüberschuss an der Pathologie der NAFLD beteiligt ist, ist der Mechanismus noch nicht vollständig geklärt, da der Krankheitszustand durch verschiedene Faktoren wie Insulinresistenz, Immunstatus und oxidativen Stress erschwert wird4,5. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass eine Eisenüberladung den Stoffwechselzustand verändern und die Leberentzündung bei der Fettlebererkrankung verstärken kann, was Aufschluss über den pathologischen Zusammenhang zwischen NAFLD und DIOS beim Menschen gibt.

DIOS wird klinisch auf der Grundlage der folgenden Befunde definiert: Vorhandensein von MetS-Komponenten, Hyperferritinämie mit normaler Transferrinsättigung und leichter Eisenüberschuss in der Leber, typischerweise mit sinusförmiger Akkumulation17,18,19,20,21. Die Pathogenese von DIOS wird jedoch immer noch diskutiert. Das vorliegende WD-Modell weist einen erhöhten Serumeisenspiegel bei normaler Transferrinsättigung auf, was auf eine normale Fähigkeit des Serumtransferrins zur Eisenbindung schließen lässt. Die Kombination einer Nahrungsergänzung mit Eisen mit westlicher Ernährung induziert eine Anreicherung von Eisen in der Leber hauptsächlich entlang des Sinusoids mit einer Hepcidin-Hochregulierung in der Leber, wie bei menschlichem DIOS und NAFLD18,19,20,37. Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind die MetS-Phänotypen zwischen dem aktuellen WD + Fe-Modell, menschlichem NAFLD und DIOS ähnlich, was auf eine phänotypische Relevanz dieses Modells für menschliches DIOS und NAFLD mit Eisenüberladung schließen lässt. Serumferritin wird in der klinischen Praxis des Menschen üblicherweise als Ersatzmarker für die Eisenspeicher im Körper gemessen, anstatt direkt Gewebeeisen zu messen38,39. Serumferritin ist jedoch unabhängig von den Eisenspeichern im Körper von Ratten, da es nur eine geringe Menge Eisen enthält40. Daher haben wir den Eisengehalt in der Leber in unserem Rattenmodell bewertet, indem wir die Eisenspeicherbedingungen im Körper mit denen beim Menschen verglichen haben. Die durchschnittliche tägliche Eisenaufnahme in den Gruppen Fe (485,2 mg/kg Körpergewicht/Tag) und WD + Fe (444,3 mg/kg Körpergewicht/Tag) ist etwa 32-mal bzw. 30-mal höher als bei Kontrollratten (15,1 mg/kg Körpergewicht). Gewicht/Tag). Bei der auf dem Körpergewicht basierenden Berechnung ist die durchschnittliche tägliche Eisenaufnahme in den Fe- und WD + Fe-Gruppen etwa 1777-mal bzw. 1940-mal höher als die durchschnittliche tägliche Eisenaufnahme von Männern (0,25 mg/kg Körpergewicht/Tag)41. Der Eisengehalt in der Leber bei NAFLD-Patienten mit Hyperferritinämie und/oder abnormalem Serumeisen beträgt 980–5070 μg/g Trockengewicht, was in der klinischen Bewertungsskala für Eisenüberladung eine normale bis leichte bis mittelschwere Eisenüberladung darstellt42,43,44. Im vorliegenden WD + Fe-Modell kann der Eisengehalt in der Leber mit 858–1574 μg/g Trockengewicht berechnet werden, was auf einen normalen bis leichten Anstieg des Eisengehalts in der Leber schließen lässt45. Es wird davon ausgegangen, dass unser WD + Fe-Modell einen ähnlichen Eisenstatus aufweist wie menschliche NAFLD-Patienten mit Eisendysregulation44.

Die Einschränkung der aktuellen WD + Fe-Modelle besteht darin, dass die hepatische Insulinresistenz nicht vollständig verändert ist wie bei typischer NAFLD und DIOS. Insulinresistenz ist zusammen mit Lipotoxizität, oxidativem Stress und der Aktivierung einer Entzündungskaskade ein wesentlicher Teil der „Multiple Hits“, die zur Entwicklung und zum Fortschreiten von NAFLD führen5. Die hepatische Insulinresistenz, definiert als beeinträchtigte Unterdrückung der Glukoseproduktion durch Insulin in Hepatozyten, ist ebenfalls eine wichtige Komponente bei Stoffwechselstörungen30,46. Die hepatische Insulinresistenz entwickelt sich vor der systemischen Insulinresistenz, was darauf hindeutet, dass die hepatische Insulinresistenz die Entwicklung einer Ganzkörperinsulinresistenz auslösen kann47. Es wurde gezeigt, dass der hepatische Insulinweg in den vorliegenden WD- und WD + Fe-Modellen teilweise verändert ist; Die nukleare Translokation von FOXO1 wurde jedoch durch die Herunterregulierung der Glykogenese-Gene nicht beeinflusst. In der Leber kann die Gluconeogenese durch PDK1-abhängige Zerlegung des cAMP-Antwort-Element-Bindungsprotein-Komplexes sowie des AKT2-FOXO1-Signalwegs unterdrückt werden48. Bei den Insulinrezeptorsubstraten sind nicht nur IRS1, sondern auch IRS2 an der Hemmung der hepatischen Glukoseausschüttung beteiligt49. Es wird davon ausgegangen, dass die Glykogenese in diesem Modell über diese alternativen Wege als Reaktion auf die Unterdrückung von IRS1-Akt 2 reguliert werden könnte. Die Fruktose- und Glukosebelastung im Trinkwasser wurde ausgewählt, um die hepatische Insulinkaskade in diesem Modell zu verändern. Fruktose- und/oder Glukoselösungen werden häufig zur Induktion von MetS-Phänotypen in Nagetiermodellen verwendet, da eine übermäßige Aufnahme von Fruktose und Glukose als Hauptursache für die Entwicklung von MetS vermutet wird47,50,51. Um in unserem Modell eine eindeutige Insulinresistenz zu erreichen, wäre es effektiv, den Zuckergehalt so stark zu erhöhen wie frühere Studien, die eine hepatische oder systemische Insulinresistenz zeigten50,52. Eine weitere Methode zur Erleichterung von MetS in unserem Modell besteht darin, die westliche Ernährung mit etablierten Diabetesmodellen, wie beispielsweise chemisch induzierten und genetisch veränderten Modellen, zu füttern. Ersteres umfasst ein T2DM-Modell mit niedrig dosierter Streptozotocin-Behandlung53. Es sollte jedoch beachtet werden, dass eine Streptozotocin-induzierte β-Zell-Störung viel schwerwiegender ist als die natürliche Pathogenese53,54. Letzteres umfasst Nagetiere mit Leptin-Leptin-Rezeptor-Achsen-Mangel (ob/ob-Maus, db/db-Maus, Zucker-Fettratte) und mit spontanem D2M (KK-Maus); Diese Tiere entwickeln eine Insulinresistenz mit Fettleibigkeit51,54. Die Kombination der Diabetes-Induktion mit westlicher Ernährung könnte ein besseres Modell hervorbringen, das menschliche NAFLD und MetS deutlicher nachahmt.

In dieser Studie verschlimmert eine Eisenüberladung in der Nahrung die durch westliche Ernährung verursachte Leberentzündung mit einer Hochregulierung von Zytokinen wie TNFα und IFNγ; Ähnliche Ergebnisse wurden in früheren Studien mit NAFLD-Modellen von Nagetieren erzielt22,55. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Verschlimmerung der Leberentzündung im vorliegenden WD + Fe-Modell mit einer intensiven Eisenakkumulation in Makrophagen/Kupffer-Zellen und einer erhöhten nuklearen Translokation von NFκB verbunden ist. Die nukleare Translokation von NFκB war besonders bemerkenswert in den Entzündungsherden des WD + Fe-Modells. TNFα wird mit Fettleibigkeit und Insulinresistenz in Verbindung gebracht und ist durch die Bindung an TNFR134,56,57 auch als Aktivator NFκB-bedingter Entzündungen bekannt. Die Expression von hepatischem und adipösem TNFα und hepatischem TNFα-Rezeptor nimmt bei adipösen NASH-Patienten im Vergleich zu adipösen Patienten ohne NASH zu58. In ähnlicher Weise ist die TNFα-Expression im vorliegenden WD + Fe-Modell sowohl in der Leber als auch im viszeralen Fettgewebe hochreguliert, was darauf hindeutet, dass aus der Leber und dem viszeralen Fettgewebe produziertes TNFα zur Verschlimmerung der Leberentzündung beitragen könnte. Eine erhöhte NFκB-Aktivität ist auch mit der Entwicklung von MetS-Komponenten wie Steatose, hepatischer Insulinresistenz und Entzündung bei Nagetieren verbunden5,57,59. Die Aktivierung von NFκB ist auch in Leberbiopsien von NASH-Patienten nachgewiesen60,61. Darüber hinaus deuten mehrere Studien darauf hin, dass übermäßiges Eisen über IΚK in kultivierten Kupffer-Zellen direkt die Aktivierung von NFκB und die Hochregulierung von TNFα induziert62,63. Die TNFα-NFκB-Wechselwirkung könnte im vorliegenden WD + Fe-Modell eine Leberentzündung fördern. IFNγ stammt größtenteils aus T-Helferzellen und ist hauptsächlich mit Immunantworten vom Th1-Typ verbunden64. Obwohl nur begrenzte Daten zur Rolle von Th1-Zellen bei menschlicher NAFLD vorliegen, wurde bei NASH-Patienten eine erhöhte Anzahl von IFNγ-produzierenden T-Zellen beobachtet65. IFNγ kann auch M1-Makrophagen aktivieren, die proinflammatorische Zytokine wie TNFα und IL1β33,66 absondern. Im vorliegenden WD + Fe-Modell waren die mononukleären Leukozyten in den Entzündungsherden stark positiv für iNOS, während sie für CD206 negativ waren, was darauf hindeutet, dass M1-Makrophagen hauptsächlich aus den Entzündungsherden bestehen. Die durch Eisen induzierte Th1/M1-Immunantwort könnte auch zur verstärkten Leberentzündung im vorliegenden WD + Fe-Modell beitragen.

Dyslipidämie ist mit ihrer hohen Prävalenz (20 % bis 80 % der NAFLD-Patienten) eines der wichtigsten klinischen Merkmale von NAFLD und MetS und wurde als Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen festgestellt67. Diese Beweise würden die Nützlichkeit dieses Modells untermauern, da es den wichtigen Phänotyp der menschlichen NAFLD mit mehreren MetS-Komponenten darstellt. Darüber hinaus erhöht eine Eisenüberladung in der Nahrung die Serumtriglyceride und das Gesamtcholesterin, nicht jedoch die Lebertriglyceride im vorliegenden WD + Fe-Modell. Graham et al. zeigten, dass die Eisenbelastung in der Leber die Lebercholesterinsynthese bei Mäusen erhöht68. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Aktivierung des NFκB-Signalwegs in Hepatozyten, wie im vorliegenden WD + Fe-Modell zu sehen ist, die Lipogenese einschließlich der Cholesterinsynthese fördert69. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Eisenüberladung in der Leber den Lipidstoffwechsel, insbesondere den Cholesterinstoffwechsel, verändern kann.

Oxidativer Stress gilt als einer der „Multiple Hits“ von NAFLD und steht vermutlich mit der Aktivierung angeborener Immunsignale während der Entwicklung von NAFLD über die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie Interferon-regulatorischen Faktoren und NFκB in Verbindung27,28,70. Eine Eisenüberladung kann durch die Bildung von Hydroxylradikalen, einer hochreaktiven Sauerstoffspezies, durch die Fenton-Reaktion zu Gewebeschäden führen9. Der Anstieg des MDA-Gehalts in der Leber, einem Marker für die Lipidperoxidation28, war jedoch im vorliegenden WD + Fe-Modell geringfügig (weniger als zweifach), ohne signifikante Änderungen der Serumtransaminasen oder des GSH/GSSG-Verhältnisses in der Leber, einem Indikator für oxidativen Stress und Antioxidans Gleichgewicht27. Darüber hinaus war die Eisenansammlung in der Leber in den vorliegenden WD + Fe-Modellen leicht bis mäßig, wie bei Patienten mit NAFLD mit Hyperferritinämie oder DIOS19,20. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine nicht hepatotoxische Eisenansammlung Dyslipidämie und Leberentzündungen über die Aktivierung von Makrophagen/Kupffer-Zellen fördern kann, anstatt bei metabolischen Lebererkrankungen eine direkte Leberschädigung auszulösen.

Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass das neue NAFLD-Modell mit hepatischer Eisenüberladung viele Merkmale der menschlichen NAFLD mit Hyperferritinämie und DIOS gemeinsam hat. Die Hinzufügung einer Eisenüberladung in der Nahrung zu einer durch westliche Ernährung verursachten Fettlebererkrankung verschlimmert die Leberentzündung mit der Aktivierung von NFκB und verändert den Lipidstoffwechsel, was darauf hindeutet, dass Eisen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Fortschreiten von NAFLD als einem der „Multiple Hits“-Faktoren spielt. Eine weitere Verbesserung des experimentellen Modells würde die Vernetzung zwischen menschlichem NAFLD und DIOS deutlicher machen.

Das in dieser Studie durchgeführte Experiment wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) berichtet. Zehn Wochen alte männliche F344/DuCrlCrlj-Ratten (Charles River Laboratories Japan, Yokohama, Japan) wurden in Kontrollratten (Con), westliche Ernährung (WD), westliche Ernährung + viel Eisen (WD + Fe) und hohe Ernährung eingeteilt. Eisen-(Fe)-Gruppen (n = 4 in jeder Gruppe); Das durchschnittliche Körpergewicht ist zwischen den Gruppen zu Beginn des Experiments ähnlich. Im Hinblick auf die Reduzierung (Minimierung der Anzahl der Tiere) und die experimentelle Genauigkeit (Minimierung des Einflusses individueller Variationen) wurde eine Stichprobengröße von vier pro Gruppe festgelegt. Zwei oder drei Ratten pro Käfig wurden in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und 12-stündigem Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Futter und Wasser wurden nach Belieben zur Verfügung gestellt. Ratten wurden 26 Wochen lang mit den in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführten Diäten gefüttert. Eine eisenreiche Diät wurde durch Mischen von Eisencitrat (FeC6H5O7・5H2O) in einer Konzentration von 6 % zubereitet. Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Wasseraufnahme wurden einmal pro Woche gemessen. Nach 26-wöchiger Fütterung wurden die Ratten unter tiefer Isoflurananästhesie eingeschläfert und Vollblut, Leber, subkutanes (inguinales) und viszerales (periepidydimales) Fettgewebe, Milz, Bauchspeicheldrüse, Blinddarminhalt, Herz, Nieren und Lunge entnommen . Alle Ratten wurden ohne Ausschluss in die unten beschriebenen Analysen einbezogen. Störfaktoren wurden in dieser Studie nicht kontrolliert; Allerdings wird der Einfluss der Reihenfolge der Behandlungen und Messungen hinsichtlich der Beobachtung der erhaltenen Daten als minimal angesehen. Zwei der Autoren (SF und TI) waren sich der Gruppenzuteilung in den verschiedenen Phasen der Experimente bewusst. Alle Experimente wurden vom Animal Care and Use Committee der Osaka Prefecture University (Codenummern 29–184 und 30–71) genehmigt und gemäß den Richtlinien für Tierversuche der Osaka Metropolitan University durchgeführt.

Aus der Bauchaorta wurde Blut entnommen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur belassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation (3000 U/min, 10 Min.) abgetrennt. Biochemische Analysen wurden bei SRL Inc. (Tokio, Japan) durchgeführt.

Der linke Seitenlappen und der Schwanz der Leber wurden in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, auf 5 µm geschnitten und zur histopathologischen Untersuchung mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Die Anzahl der Entzündungsherde wurde gezählt. Von jedem Tier wurden zehn 200-fache Felder linker Seitenlappenabschnitte ausgewertet. Die Daten wurden als Anzahl der Entzündungsherde pro 200 × Feld dargestellt.

Um den Triglyceridgehalt in der Leber zu untersuchen, wurde ein Lebertriglyceridtest mit dem Triglycerid-E-Test-Wako-Kit (Wako Pure Chemical Industries, Tokio, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Schnitte aus dem linken Seitenlappen und dem Schwanz der Leber wurden einer Immunhistochemie (IHC) mit Primärantikörpern unterzogen, wie in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Nach dem Entparaffinieren und der Antigengewinnung wurden die Gewebeschnitte wie zuvor beschrieben in einem Histostainer-System (Nichirei Biosciences, Tokio, Japan) immungefärbt71. Kurz gesagt, die Schnitte wurden 10 Minuten lang mit 5 % Magermilch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), mit jedem Primärantikörper 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, 15 Minuten lang mit 3 % H2O2 in PBS und mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Sekundärantikörper behandelt (Histofine Simple Stain MAX PO; Nichirei Biosciences) bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Positive Reaktionen wurden mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB-Substratkit; Nichirei Biosciences) sichtbar gemacht. Nach der Immunhistochemie wurden die Schnitte zum Nachweis von Gewebeeisen mit Perls-Lösung gefärbt.

Die Seruminsulinspiegel wurden mit dem LBIS Rat Insulin ELISA Kit (Shibayagi Co., Gunma, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

Um die Veränderung der Lipidperoxidation zu untersuchen, wurden die MDA-Gehalte in der Leber mit der Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS)-Methode unter Verwendung eines MDA-Assay-Kits (Northernwest Life Science Specialities, Vancouber, Kanada) wie zuvor beschrieben71 analysiert.

Um die antioxidative Aktivität in der Leber zu untersuchen, wurde das GSSG/GSH-Verhältnis in der Leber unter Verwendung eines GSSG/GSH-Quantifizierungskits (Dojindo, Kumamoto, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

Eine Echtzeit-RT-PCR wurde durchgeführt, um die Expressionsmuster wichtiger Zytokin-Gene und Gene im Zusammenhang mit dem Eisenstoffwechsel zu untersuchen, wie zuvor beschrieben71. Leberproben aus dem rechten Mittellappen, epidydimalem Fettgewebe und Leistenfettgewebe wurden in RNA Later Regent (Qiagen, Hilden, Deutschland) getaucht und vor der Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines SV Total RNA Isolation System (Promega, WI, USA) extrahiert. Zweikommafünf Mikrogramm Gesamt-RNA wurden mit dem SuperScript VILO cDNA-Synthesekit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) revers in cDNA transkribiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit TaqMan-Genexpressionstests (Life Technologies) in einem PikoReal Real-Time 96 PCR-System (Thermo Scientific, Massachusetts, USA) durchgeführt. Einzelheiten zu den Sonden sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt. Als Referenzgene wurden eukaryotische 18sRNA und βactin verwendet. Die Daten wurden mit der 2−ΔΔCT-Methode berechnet.

Ganze Gewebehomogenate aus dem rechten Mittellappen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt71. Zur Vorbereitung der zytoplasmatischen/nuklearen Fraktionen wurden die Leberproben aus dem rechten Mittellappen in einem Puffer homogenisiert, der 10 mM HEPES/KOH (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl, 0,5 % NP-40, 1 mM PMSF und enthielt Proteinase-Inhibitor-Cocktail. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 3100 × g wurde der Überstand als zytoplasmatische Fraktion gesammelt. Der Niederschlag wurde mit 200 μl eines anderen Puffers gemischt, der 10 mM HEPES/KOH (pH 7,5), 25 mM NaCl, 3 mM MgCl, 300 mM Saccharose, 1 mM PMSF und einen Proteinase-Inhibitor-Cocktail enthielt, und 5 Minuten lang bei 3100 × g zentrifugiert. Nach Behandlung mit 10 mg/ml DNase I und Ultraschallbehandlung auf Eis wurde die Probe als Kernfraktion gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Absorptionsspektrometer unter Verwendung des Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) bestimmt. Die Proben wurden auf Polyacrylamidgelen mit einem Gradienten von 5–20 % aufgetrennt und auf Membranen aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) (Bio-Rad Laboratories) übertragen. Die Membranen wurden vor der Inkubation mit Primärantikörpern der Größe nach in mehrere Stücke geschnitten und dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert, wie in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper (Histofine Simple Stain MAX PO; Nichirei Biosciences) für 30 Min. Die Signale wurden mit ECL prime (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) visualisiert und mit einem Lumineszenzbildanalysator (LAS-4000; GE Healthcare) quantifiziert. Die analysierten Bandenbilder sind in der ergänzenden Abbildung S6a – m dargestellt.

Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von einem Tukey-Kramer-Test mit einer Prism-Software (Version 9.4.1.; GraphPad, San Diego, CA, USA; https://www.graphpad.com/scientific-software/) durchgeführt. Prisma/). Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken Tomoe Matsuo, Nana Hamachi und Youko Igakura für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wird von JSPS KAKENHI (Grant-Nummer 20K06415) unterstützt.

Labor für Veterinärpathologie, Osaka Metropolitan University, 1-58 Rinku-Orai-Kita, Izumisano, Osaka, 598-8531, Japan

Sakura Fujiwara, Takeshi Izawa, Mutsuki Mori, Machi Atarashi, Jyoji Yamate und Mitsuru Kuwamura

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Korrespondenz mit Takeshi Izawa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fujiwara, S., Izawa, T., Mori, M. et al. Eine Eisenüberladung in der Nahrung verstärkt die durch westliche Ernährung verursachte Leberentzündung und verändert den Lipidstoffwechsel bei Ratten, die Ähnlichkeiten mit menschlichem DIOS aufweisen. Sci Rep 12, 21414 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25838-3

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Eingegangen: 27. Juni 2022

Angenommen: 06. Dezember 2022

Veröffentlicht: 10. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25838-3

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